Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных
.pdfпередачей) человека и многих других млекопитающих. О существовании родствен-
ных эндогенных вирусов сведений нет. Лентивирусы приматов отличаются по ис-
пользованию хемокинового рецептора, протеина CD4 и по отсутствию DU. Некото-
рые группы проявляют перекрестную активность по антигенамGag (лентивирусы овец, коз и кошек). Вирусы, родственные Feline immunodificiency virus (FIV) были выделены от других крупных кошачьих (например, Рита lentivirus), а наличие анти-
тел к антигену Gag у львов и других крупных кошачьих свидетельствует о сущест-
вовании других вирусов, близких FIV и лентивирусам овец и коз.
Вирусы ассоциируются с различными болезнями, включая иммунодефициты,
нейрологические нарушения, артриты и др. Онкоген-содержащие вирусы не обна-
ружены.
Критерии подразделения на виды внутри рода. Для подразделения на виды используются следующие критерии:
·нуклеотидный и аминокислотный сиквенс;
·антигенные свойства;
·спектр естественных хозяев;
·патогенность.
На основе различий по спектру восприимчивых хозяев лентивирусы были подразделены на 5 групп (лентивирусы приматов, овец и коз, лошадей, кошек и КРС). Внутри группы лентивирусов приматовHIV-1 отличается от HPV-2, прежде всего по дивергенции нуклеотидных сиквенсов, которая превышает 50 %, и по на-
личию у HIV-2 гена vpx. Показана ограниченная перекрестная реактивность в ELISA
на основе Gag-антигенов; по продукту гена env перекрестной активности нет. В на-
стоящее время официально зарегистировано 10 видов.
Род: Spumavirus
Типовой вид: Chimpanzee foamy virus (CFV) (пенящий вирус шимпанзе).
Характерные особенности. Вирион имеет характерную морфологию, со сла-
бозаметными поверхностными выступами и центральным неплотным ядром. Сборка капсида происходит в цитоплазме, после чего он отпочковывается в эндоплазмати-
ческую сеть или через плазматическую мембрану. Для почкования капсида не-
401
обходим протеин Env. Нет сведений о разрезании в инфекционном вирионе протеи-
на-предшественника Gag до субъединиц MA, CA, NC. Молекулярная масса протеи-
нов: Gag-предшественник ± 74 ´ 103 N-концевой продукт разрезания Gag± 70 ´ 103; Pol-предшественник ± 127 ´ 103; RT ± 80 ´ 103; IN ± 40 ´ 103; Env-предшественник ±
130 ´ 103; SU ± 80 ´ 103; ТМ ± 48 ´ 103; Itas/Bel ± 35 ´ 103; Bet (Bel-l/Bel-2 fusion protein) ± 60 ´ 103; Env-Bet fusion protein ± 170 ´ 103. Размер генома 11,6 kb; расположе-
ние генов: gag-pro-pol-env-tas-bet, Tas является ДНК-связывающим протеином с трансактиваторной функцией. Функции другого дополнительного протеина не из-
вестны. Размер LTR 1770 нуклеотидов, 1400 нуклеотидов –регион U3, 200 нуклео-
тидов – R, 150 нуклеотидов – U5. У вирусов КРС и кошек размер соответствует от
950 до 1000 нуклеотидов. Спумавирусы могут использовать два сайта начала транс-
крипции: R a LTR и внутренний промотор (IP), расположенный выше дополнитель-
ных рамок считывания в генеenv. Активность обоих промоторов зависит отTas.
Другим важным критерием отличия спумавирусов от представителей других родов семейства Retroviridae – экспрессия протеина Pol со сплайсированной субгеномной мРНК и присутствие в вирионе большого количества обратнотранскрибированной ДНК.
Вирусы распространены повсеместно, экзогенные вирусы найдены у многих млекопитающих. Естественного инфицирования людей не зарегистрировано, отме-
чались редкие случаи заражения людей от нечеловекообразных обезьян. Есть дан-
ные о существовании родственных(но не близких) эндогенных вирусов. Многие изоляты вызывают характерную «пенистую» цитопатологию в культуре клеток. Бо-
лезней, ассоциированных со спумавирусной инфекцией, не отмечается. Онкоген-
содержащих вирусов не обнаружено.
Критерии подразделения на виды внутри рода. Для подразделения на виды используются следующие критерии:
·нуклеотидный и аминокислотный сиквенсы;
·спектр естественных хозяев.
Внастоящее время официально зарегистировано 5 видов.
402
14.2 РНК-содержащие вирусы
14.2.1 Семейство: Reoviridae
Род: Orthoreovirus, Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Aquareovirus, Cypovirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus
Характеристика вириона. Вирион икосаэдральной симметрии, но может вы-
глядеть сферическим. Состоит из капсида, сформированного концентрическими протеиновыми слоями, в виде 1 – 3 четких капсидных чехлов, имеющих внешний диаметр от 60 нм до 80 нм. Вирусы девяти родов можно подразделить на две груп-
пы. Одна группа содержит вирусы, интактные вирусные частицы (или коры) кото-
рых содержат относительно большие выступы(spikes) или «башенки», расположен-
ные на 12-ти вершинах экосаэдра (включая Orthoreovirus, Aquareovirus, Cypovirus, Fijivirus, Oryzavirus и, как и большинство неклассифицированных вирусов беспо-
звоночных). Вторая группа включает роды, вирусы которых имеют ровные или поч-
ти сферические вирионы и кор без крупных поверхностных выступов по вершинам
(Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Phytoreovirus).
Важно отметить, что номенклатура для описания вирусных частиц с различ-
ным числом интактных капсидных слоев варьирует у разных родов, хотя данная но-
менклатура может использоваться в любом случае. Транскрипционно активные ко-
ровые частицы вирусов, имеющих выступы, имеют только один полный капсидный слой (с симметрией Т = 2), к которому прикрепляются выступы (спайки – spikes). У
интактных вирусных частиц кор обычно окружен неполным протеиновым слоем(с
симметрией Т = 13), который перфорирован спайками, и образует внешнее капсид-
ное покрытие. Поэтому, вирусные частицы обычно выглядят имеющими двухслой-
ный чехол. Исключение составляют cypoviruses, имеющие вирион только с одной капсидной оболочкой, эквивалентной «коровой» частице вирусов других родов. У
вирусов рода Cypovirus транскрипционно активная частица с одной оболочкой явля-
ется интактным вирионом, хотя характерным является то, что частицы некоторых cypovirases могут смыкаться внутри матрикса протеиновых кристаллов, называемых
403
полиэдрами (polyhedra), которые образованы более чем на90 % вирусным протеи-
ном – «полиэдрином». В противоположность этому, вирусы с гладким кором содер-
жат субкор, который может быть относительно хрупким, с полным протеиновым чехлом (Т = 2), который усилен у транскрипционно активных коровых частиц пол-
ным слоем коровой оболочки (Т = 13). Такие дважды покрытые коровые частицы, не имеют поверхностных выступов (спайков) и в интактном вирионе окружены внеш-
ним капсидным чехлом, приобретая вид частиц с тремя слоями оболочки. Самый внутренний протеиновый чехол вирусного капсида имеет диаметр от 50 нм до 60 нм и окружает 1042 геномных сегментов, представленных линейными двуспиральными РНК. Для вирусов с гладким кором характерно то, что энзиматически активные ми-
норные протеины вириона также расположены внутри центрального пространства, и
прикреплены к внутренней поверхности (с пятиосевым типом симметрии) (включая РНК-зависимую РНК полимеразу(транскриптазу и редуктазу), NTPase, хеликазу,
кэпирующие и трансметилазные энзимы). Для вирусов, имеющих кор с выступами,
некоторые из протеинов-энзимов формируют«башенки» на поверхности кора. Вы-
ступы, имеющие внутри полость, используются как каналы для выхода образую-
щихся мРНК, синтезируемых энзимами, связанными с кором.
Частицы вирусов, принадлежащих разным родам, могут покидать инфициро-
ванную клетку почкованием (Orbivirus) или почковаться внутрь эндоплазматическо-
го ретикулума (Rotavirus), приобретая мембранную оболочку, клеточного происхо-
ждения, хотя во многих случаях оболочка сохраняется не долго. У вирусов некото-
рых родов протеины внешнего капсида могут быть модифицированы протеазами
(такими как трипсин и химотрипсин), что приводит к образованию «инфекционных» или «промежуточных субвирусных частиц». Такие изменения могут привести к из-
менению параметров частицы, определяющих прикрепление и проникновение в клетку.
Диаметр вириона от 60 нм до 80 нм; Mr 120 ´ 103; плавучая плотность в CsCl
от 1,36 г/см3 до 1,39 г/см3. Вирусные частицы умеренно резистентны к нагреванию,
органическим растворителям (например, эфиру) и неионным детергентам. Стабиль-
ность при различных значениях рН у представителей разных родов различна.
404
Геном. РНК: двуспиральная, линейная, сегментированная (10-12); от 15 % до
20 % сухой массы вириона. Mr отдельных молекул РНК составляет от0,2 ´ 106 до
3,0 ´ 106, всей РНК – от 12 ´ 106 до 20 ´ 106. Вирион содержит позитивные и нега-
тивные цепи РНК в равных пропорциях– одна копия каждого сегмента на вирион.
Интактные вирионы некоторых видов содержат также значительное количество ко-
ротких односпиральных РНК. Позитивные цепи каждого дуплекса кэпированы по 5'-
концу (структура типа 1). Обе цепи РНК имеют 3'-ОН, и вирусные мРНК не имеют
3'-поли-А.
Другие компоненты вириона. Протеины составляют от 80 % до 85 % сухого веса вириона. Размер протеинов варьирует по Mr от 15 ´ 103 до 155 ´ 103. Структур-
ными компонентами вириона являются три мажерных капсидных протеина(СР) и
некоторые из минорных протеинов. Не менее трех внутренних вирусных структур-
ных протеинов составляют полимеразу и другие ассоциированные энзимы, участ-
вующие в процессе синтеза мРНК и кэпировании(включая полностью консерватив-
ную dsRNA-зависимую ssPHK полимеразу (транскриптазу), нуклеотидфосфогидро-
лазу, гуанилинтрансферазу, две трансметилазы и dsRNA-хеликазу).
Зрелый вирион не содержит липидной оболочки. В зависимости от рода мири-
стиловые остатки могут быть ковалентно связаны с одним из вирусных протеинов.
Для рота- и орбивирусов характерно приобретение липидной оболочки на промежу-
точной стадии морфогенеза или при выходе из клетки, которая впоследствии теря-
ется.
У вирусов некоторых родов, один из поверхностных протеинов, а также мел-
кие неструктурные вирусные протеины могут быть гликозилированы.
Организация генома и репликация. Вирусные РНК в основном моноцистрон-
ные, хотя некоторые сегменты имеют второй функциональный инициирующий ко-
дон или другие ORFs. Протеины кодируются только на одной цепи(мРНК) каждого дуплекса. Проникновение вируса в клетку различается у представителей разных ро-
дов, но обычно является результатом потери компонентов внешнего капсид.
Транскрипционно активные родительские вирусные частицы (коры) высвобождают-
405
ся в цитоплазму клеток. Повторяющаяся асимметричная транскрипция полнораз-
мерных мРНК каждого сегментаdsRNA (двуспиральной РНК) происходит внутри этих частиц. Продукты мРНК, образующиеся в большом количестве с меньших сег-
ментов, выводятся через вершины икосаэдральной частицы. Структуры, обозначае-
мые вироплазмами или вирусными тельцами-включениями, встречаются в отдель-
ных областях цитоплазмы, являющихся местами репликации и сборки вновь обра-
зуемых вирусов. При электронно-микроскопическом исследовании вироплазмы вы-
глядят гранулярными средней электроноплотности и могут содержать вновь обра-
зующиеся вирусные частицы. Компоненты внешнего капсида приобретаются на пе-
риферии вироплазм.
Механизм синтеза и ассемблирования генома изучен недостаточно. Относи-
тельно ортореовирусов показано, что кэпированные мРНК и определенныеNS про-
теины инкорпорируются внутрь «комплекса», считающегося предшественником бу-
дущих вирусных частиц. Затем мРНК используется в качестве матрицы для одного раунда синтеза негативной цепи, с образованием сегментов dsRNA. Разные мРНК находятся в цитоплазме в разных соотношениях. Однако dsRNA геномные сегменты обычно упаковываются в точном эквимолярном соотношении(одна копия каждого геномного сегмента в одной частице). Сегменты РНК имеют консервативные тер-
минальные последовательности по обоим концам, которые используются как сигна-
лы распознавания для РНК транскриптазы или репликазы. Эти сиквенсы также мо-
гут иметь значение для селекции и инкорпорирования РНК внутрь новых частиц.
Для одного рода описано, что РНК зрелых частиц упаковывается в виде серии кон-
центрических и высокоорганизованных чехлов(shells), с элементами икосаэдраль-
ной симметрии.
Кроме родительских субвирусных частиц(коров), вновь образованные коры также синтезируют мРНК, обеспечивая этап амплификации и репликации. В зави-
симости от рода, некоторые протеины NS участвуют в транслокации вирусных час-
тиц внутри клетки и их выходе. Многие cypoviruses формируют также полиэдры,
являющиеся крупными кристаллическими протеиновыми матрицами, включающи-
ми вирусные частицы, и участвующими в трансмиссии между отдельными насеко406
мыми-хозяевами. Этапы морфогенеза и высвобождения вируса зависят от рода. Ре-
ассортация сегментов генома происходит легко в клетках, коинфицированных виру-
сами одного вида.
Антигенные свойства. Вирусы позвоночных имеют групповые или серо-
групповые (видоспецифические) антигены, а внутри каждой серогруппы – более ва-
риабельные серотип-специфические антигены. Вирусы насекомых и растений могут проявлять меньшую вариабельность по протеинам, вероятно из-за отсутствия анти-
тело-опосредованного селективного прессинга. Между родами антигенного родства не установлено. Некоторые вирусы обладают гемагглютинирующими свойствами.
Биологические особенности. Биологические особенности вирусов зависят от их родовой принадлежности. Некоторые вирусы репродуцируются только в опреде-
ленных видах позвоночных и передаются между хозяевами алиментарно или аэро-
зольно. Другие вирусы позвоночных(орби- и колтивирусы) реплицируются как в позвоночных, так и в беспозвоночных (москиты, клещи, комары и др.). Вирусы рас-
тений реплицируются как в растениях, так и в членистоногих(векторах). Вирусы патогенные для насекомых (cypoviruscs) передаются контактно или алиментарно.
Критерии подразделения на виды внутри семейства. Главным критерием для включения вирусного изолята в тот или иной вид внутри семейства является способность к реассортации сегментов генома во время коинфекции. Однако пря-
мых свидетельств реассортации сегментов генома между разными вирусны штаммами недостаточно, поэтому для анализа родства, сходства и различий исполь-
зуются другие методы: идентификация естественных хозяев и векторов, клиниче-
ское проявление, серологические особенности, сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных сиквенсов, перекрестная гибридизация РНК и кДНК, анализ кон-
сервативных областей генома, определение серотипа, определение электрофоретипа
(анализ профиля миграции сегментов генома при электрофоретическом разделении),
амплификация консервативных областей с использованием ПЦР(с последующим анализом продуктов в перекрестной гибридизации, рестрикционном анализе и сек-
венированием).
Миграция dsRNA геномных сегментов при электрофорезе в полиакриламид407
ном геле (PAGE) сильно зависит от первичной структуры и Mr молекул. Однако ми-
грационные характеристики при электрофорезе в агарозном геле(AGE) зависят только от Mr. Поэтому последний вариант может быть более удобным для иденти-
фикации и дифференциации вирусных видов с использованием электрофоретипиро-
вания, тогда как PAGE более чувствителен и может быть использован для более тонкой дифференциации между штаммами внутри одного вида.
Род: Orthoreovirus
Типовой вид: Mammalian orthoreovirus (MRV)
Характерные особенности. Инфицируют только позвоночных, распростра-
няются аэрозольным и алиментарным путями. Все члены рода имеют: 1) хорошо определяемую, при негативном контрастировании, капсидную структуру; 2) 10 сег-
ментов dsRNA, представленных тремя крупными(L), тремя средними (М) и че-
тырьмя мелкими (S) сегментами; 3) характерный протеиновый профиль с тремяX
первичными продуктами трансляции; 4) 1-2 дополнительных очень мелких протеи-
нов, кодируемых полицистронным геномным сегментом; 5) все члены двух вторых подгрупп индуцируют образование синцития.
Морфология. Вирион икосаэдральной симметрии, но может выглядеть сфери-
ческим, имеет двойную протеиновую капсидную оболочку. Криоэлектронная мик-
роскопия на примере MRV и ARV показала следующее строение вириона. Вирион состоит из центральной части(диаметр 48 нм), содержащей сегменты dsRNA, и
внешнего капсида (диаметр 85 нм), имеющего икосаэдральную симметрию (Т = 13).
Поверхность вириона покрыта 600 пальцевидными выступами (отростками, длиной
10 нм), организованными в 60 гексамерных и 60 тетрамерных кластеров, которые окружают каналы (диаметром от 5 нм до 8 нм), радиально проникающие через внешний капсидный слой и достигающие центральной полости. Интактные вирионы содержат большие открытые углубления, имеющие форму цветка(пятичленного),
придающего капсиду при трехмерном анализе угловой профиль. Промежуточные субвирусные частицы (ISVP), образующиеся при частичном удалении внешних кап-
сидных протеинов, имеют диаметр примерно 80 нм. Цветкообразные структуры мо-
гут включать увеличенную форму протеинаol, участвующего в прикреплении к
408
клетке, расположенного по вершинам в виде спайка длиной40 нм. Коровые части-
цы, образуемые при более значительном удалении внешних капсидных протеинов,
имеют на своей поверхности 150 эллипсоидных узелков и своеобразных «башенок»,
расположенных на пятиугольных вершинах.
Мг(вириона) 130 ´ 106, плавучая плотность в CsCl 1,36 г/см3 (1,38 г/см3 – для
ISVPs, 1,43 г/см3 – для коровых частиц). Вирионы достаточно стабильны при силь-
ных ионных воздействиях, температуре до 55 °С, значениях рН от 2 до 9, воздейст-
вии жирорастворителей и детергентов. УФ облучение снижает инфекционность.
Геном. 10 сегментов линейных двуспиральных РНК, Mr от 0,6 ´ 106 до
2,6 ´ 106. По анализу подвижности в геле сегменты были подразделены на три груп-
пы: L (L1-L3; от 3,8 kbp до 3,9 kbp), M (M1-M3; от 2,2 kbp до2,3 kbp) и S (S1-S4; от
0,9 kbp до 1,6 kbp).
Полная вирусная частица содержит многочисленные олигонуклеотиды(дли-
ной от 2 до 20 оснований), составляющих примерно 25 % общего содержания РНК,
три четверти которых представляют собой абортивные повторяющиеся5'-концевые транскрипты, образованные кор-ассоциированными транскриптазой и кэпирующи-
ми ферментами, тогда как остальное составляют олигоаденилаты. Геномные РНК не имеют поли-А, и не содержат ковалентно связанных протеинов
Протеины. Структурные протеины ортореовирусов обозначаются в соответ-
ствии с их относительной массой и классом. Стабилизированная структура внешне-
го капсида состоит из 200 тримеров продуктов разрезания протеина u1 (Mr 76 ´ 103,
после разрезания – Mr 72 ´ 103 и Mr 4 ´ 103). Пентамерные субъединицы протеина Х2 формируют цветкообразные структуры и «башенки» по вершинам вириона и ко-
ра. Структуры протеина X1 взаимодействуют с тетрамерными субъединицами про-
теина а3 и с протеином рЛС, составляя основу внешнего капсида. Протеин Х2 свя-
зан с кором вириона. Четвертый компонент внешнего капсида протеин cl, представ-
лен в виде 12 гомотримеров, связанных с вершинами вириона. Протеины X1 и а2 (по
120 копий каждый) представляют собой мажерные структурные протеины внутрен-
него капсида и взаимодействуют с геномом(обладают способностью связывать
409
dsRNA (двуспиральные РНК). Два структурных протеина вируса Х3 и ц2 представ-
лены в вирионе 12-ю копиями, расположенными внутри внутреннего капсида. Про-
теин Х3 формирует отростки длиной 7 нм, простирающиеся по направлению внут-
ренней части кора, и образующие нижележащий слой 12-ти вершин капсида. Проте-
ин ц2, вероятно, связан со структурами протеина Х3.
Организация генома и репликация. Геном представлен 10 сегментами dsRNA, упакованных в эквимолярном соотношении(одна копия сегмента на вири-
он). Сегменты содержат терминальные NTRs, которые короче по 5'-концам (соот-
ветственно от 12 bр до 32 bр и от 35 bр до 38 bр для MRV-3). Большинство сегмен-
тов имеют мажерную ORF (от 353 до 1298 кодонов). Один геномный сегмент поли-
цистронный, содержит более чем одну функциональную ORF.
Полный процесс инфекции включает адсорбцию, проникновение и раздевание коровых частиц (зависящие от низких рН), асимметричную транскрипцию кэпиро-
ванных неполиаде-нилированных мРНК(с использованием консервативных меха-
низмов – новая цепь смещается), трансляцию, ассемблирование плюс-цепей внутрь новых субвирусных частиц, переход плюс-цепи в двуспиральную РНК и дальней-
шие раунды транскрипции и трансляции мРНК. Финальная стадия репликативного цикла включает ассемблирование внешнего капсида и новых субвирусных частиц, с
образованием инфекционных вирионов. Такие частицы скапливаются в виде пара-
кристаллов в перинуклеарных участках ядерной цитоплазмы и высвобождаются по-
сле лизиса клетки. Подгруппы 2 и 3 (ARV. BRV и NBV) образуют мультиядерный синцитий (через 10-12 часов от начала инфекции).
Антигенные свойства. Серотип-специфическим антигеном ортореовирусов,
взаимодействующим с нейтрализующими антителами является протеин ст1. На ос-
нове этих антигенов различают3 серотипа MRV и 5-11 серотипов ARV. Протеины
MRV ст1 нст1s проявляют штаммовую специфичность и перекрестную цитотокси-
ческую l'-клеточную активность. Протеины MRV X2 и а3 являются группоспецифи-
ческими антигенами, аналогичными протеинам ARV Х2В и ст2/стВ. Гомология по сиквенсу отмечается только между штаммами внутри вида. Наиболее сильное анти-
генное сходство показано в отношении ARV и NBV.
410