Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология

ют вышеуказанную антисыворотку в определенном за­ ранее разведении.

Вцелях серодиагностики в агаровых пластинках вы­ резают антигенные лунки, в которые помещают смесь сока из испытуемого растения с 2,5%-ным раствором пирролидина в соотношении 1:4. Чтение реакции через 24—48 ч. При положительной реакции вокруг лунки образуется кольцо преципитации. Известна модифика­ ция этого метода (для сферических и палочковидных ви­ русов), при которой непосредственно в агар помещают кусочки анализируемых листьев.

ВГДР этот метод внедрен в практику семеновод­ ства картофеля при оздоровлении его от вирусов ХВК, SBK, МВҚ, УВК; применяют его и в качестве быстрого теста при диагностике шарки слив. По степени чувст­ вительности метод аналогичен капельному, но превос­ ходит его по производительности.

Энзимосвязанный иммуносорбентный тест (ЭЛИЗАтест) — высокочувствительный серологический метод, в основе которого лежит использование связанных с эн­ зимами антител для определения специфических антиге­ нов (т. е. вирусов растений). Применим для диагности­ ки вирусов с любой формой вирионов. Может быть ис­

пользован для выявления вирусов в семенах, а также

вплодовых и ягодных растениях.

Вкачестве энзимов , в фитовирусологии используют щелочную фосфатазу с ее субстратом р-нитрофенил фос­ фатом.

Принцип этого метода состоит в следующем: антитела, специфичные для определенного вида ви­

руса, адсорбируются на специальных пластиковых пла­ стинах с углублениями — колодцами (0,5 мм). С этой целью в колодцы добавляется раствор у-глобулиновой фракции антисыворотки;

после инкубирования неадсорбированные антитела отмываются и добавляется сок больного растения.-*Если вирус присутствует в соке, он будет реагировать с ад­ сорбированными антителами и, таким образом, связы­ ваться с пластинкой;

в колодцы прибавляется раствор, содержащий анти­ тела, связанные с энзимом. Если вирус находится в ко­ лодце, то он связывается с энзимом. При промывании удаляется несвязанный конъюгат и в колодец добав­ ляется энзимный субстрат.

После инкубационного периода измеряется актив­ ность энзима. Количество гидролизата прямо пропор­ ционально количеству вируса. Интенсивность окраски также пропорциональна концентрации вируса.

За рубежом ЭЛИЗА-тест апробирован и признан перспективным при диагностике шарки слив, тристезы цитрусовых, вируса обыкновенной мозаики огурца (в внрофорных тлях), мозаики сои, мозаики гороха (в се­ менах), крапчатости гвоздики, скручивания листьев картофеля, карликовой мозаики кукурузы, желтой кар­

ликовости ячменя и других вирусных болезней.

Метод растений-индикаторов. Индикаторным назы­

вают растение, которое дает четкую реакцию на дан­ ный вирус, сравнительно легко отличимую от реакции этого же вида растения на другие вирусы. Например, Nicotiana glutinosa L. является растением-индикатором на ВТМ. В ответ на заражение этим вирусом через 2—3 дня на. инокулированных листьях развиваются не­

кротические пятна. Название «индикатор на ВТМ» не означает, что N. glutinosa не поражается другими виру­ сами, однако ее реакция на ВТМ является специфиче­ ской.

Нередко для точного определения какого-либо виру­ са этим методом используется 2...3 вида растений-инди­ каторов. Бывают и такие случаи, когда один и тот же индикатор пригоден для диагностики нескольких ви­ русов.

По типу реакций растения-индикаторы подразделя­ ются на три группы: 1) растения с местной (локальной)

реакцией на заражение вирусом, проявляющейся толь­ ко па том листе (или листьях), который был инокулирован инфекционным соком, 2) растения-индикаторы с

системной реакцией, развивающейся в виде мозаики, деформации, различных узоров, некротических пораже­ ний и пр. на различных органах растения, и 3) рас­ тения-индикаторы со смешанной реакцией на вирус — сначала реакция проявляется на инокулированном ли­ сте, а через несколько дней инфекция развивается си­ стемно, по всему растению.

При диагностике методом индикаторных растений иногда используется способность вирусов системно за­ ражать (или, наоборот, не вызывать реакции) различ­ ные виды того же семейства, к которому относится ис­ пытуемое растение. Набор таких индикаторов, нося­

щих название растений-дифференциаторов, используется, например, при 'диагностике вирусов злаков, механи­ чески передаваемых только на растения семейства зла­ ковых (вирусы полосатой мозаики пшеницы, мозаики пырея, мозаики райграса и др.).

В число растений-индикаторов могут включаться растеннй, как поражаемые данным вирусом в природе, так и не поражаемые. Известно, напрнмер, что табак и огурец поражаются в природе мозаикой, вызванной ви­ русом обыкновенной мозаики огурца. Когда на огурцах обнаружена мозаика и требуется проверить, ие вызвана ли она указанным вирусом, то в качестве индикатора может быть использован табак. Наоборот, если найде­ на мозаика на табаке и требуется выявить этиологию заболевания, роль растения-индикатора может играть огурец. В то же время имеется индикатор, не поражае­ мый этим вирусом в природе. Это Chenopodium quinoa, реагирующий на вирус обыкновенной мозаики огурца образованием локальных пятен.

Метод растений-индикаторов пригоден также для диагностики смешанных вирусных инфекций и выделе­ ния отдельных вирусов из смеси, для определения кон­ центрации вирусов методом биологического титрования (в этом случае используются тест-растения с локаль­ ной реакцией на вирус).

Знание растений-индикаторов позволяет применять их для размножения вирусов с целью получения очи­ щенных вирусных препаратов, предназначенных для изучения морфологии вирионов и приготовления диа­ гностических сывороток. Например, N. clevelandi ис­ пользуют для размножения rattle-вируса (вируса по­ гремковости табака — возбудителя некроза клубней кар­ тофеля). Травянистые индикаторы — огурец сорта Дели­ катес и различные виды Chenopodium — применяют для накопления некоторых вирусов плодовых культур, а то­

маты сортов Невский и Звездочка — для получения ан­ тигена SBк.

Посредством индикаторных растений в ряде случаев представляется возможным выявление штаммовых раз­ личий вирусов.

Иллюстрацией может служить дурман (Datura stramo­ nium), который реагирует на обыкновенный штамм ХВК системной мозаикой на отрастающих листьях, в то вре­ мя как при поражении некротическим штаммом ХВК

наблюдается образование локальных и системных не­ кротических пятен и колец, Что приводит растение к преждевременной гибели. Кроме различий в симптомах на одном и том же виде индикатора, разные штаммы вирусов отличаются также кругом поражаемых ими рас­ тений-индикаторов. Например, есть штаммы вируса мо­ заики люцерны, поражающие огурцы, штаммы ВТМ, по­ ражающие яблоню, бобовые культуры, картофель.

Виды растений в различной степени восприимчивы к вирусам. В настоящее время для использования в ка­ честве индикаторов привлечено свыше 600 видов, отно­ сящихся к 43 семействам и 175 родам. Однако в прак­ тике фитовирусологии наиболее часто употребляют как индикаторные растения, принадлежащие к семействам пасленовых (Solanaceae), маревых (Chenopodiaceae), бобовых (Leguminosae), тыквенных (Cucurbitaceae), злаковые (Gramineae), амарантовых (Amaranthaceae). Среди представителей этих семейств есть такие индика­ торы, которые реагируютна многие вирусы. Из семей­ ства Solanaceae к таковым можно отнести Nicotiana tabacum L., N. clevelandi A. Gray, N. glutinosa' L„ N. debneyi L., Petunia hybrida Hort., Lycopersicon esculentum Mill., Datura stramonium L., Hyosciamus niger L., Physalis floridana Rydb., из семейства Chenopodiaceae — Chenopodium amaranticolor Costa et Reyn, Ch. quinoa Willd., Ch. murale L., из семейства Leguminosae — Phaseolus vulgaris L., Vicia faba L., Vigna sinensis Endi, из семейства Gramineae — Zea mays L., из семейства Ama­ ranthaceae — Gomphrena globosa L.

Примеры различных типов тест растений па вирусы,

ет выращивать изолированно, в теплицах на стерилизо­ ванной, хорошо удобренной почве. Большинство инди­ каторов (различные виды Табаков, дурман, гомфрена, физалис и др.) сначала высевают в горшки диаметром 25 см, а затем" пикируют по одному растению в горш­ ки диаметром 7...8 и 10...12 см. Горшки предварительно

дезинфицируют в 5%-ном растворе марганцовокислого калия или в 5— 10%-ном растворе тринатрийфосфата

(2—3 ч). Оптимальные условия для работы с растения- ми-индикаторами: температура воздуха 20,..25°С, осве­ щенность 2... 10 тыс. лк.

щихся первичным семеноводством картофеля, широко используется заражение отдельных листьев индикато­

во влажные камеры с определенным температурным режимом в зависимости от исследуемого вируса. Эта

заражаются в фазу двух-трех настоящих листьев, а в отдельных случаях—в фазу развития примордиальных (для вируса мозаики люцерны на фасоли) и семядоль­ ных листьев (для вируса некроза табака на огурце).

Однодольные растения (например, злаковые) более вос­ приимчивы к вирусам в фазе одного-двух листьев. Чув­ ствительность к вирусам повышается, если перед зара­ жением растения-индикаторы на 2...3 суток помещены

взатенение.

Вбольшинстве случаев растения-индикаторы зара­

жают механически — путем натирания листьев соком из испытуемого растения. Листья образцов растираются пестиком в фарфоровой ступке, предварительно продез­ инфицированной кипячением в течение 20 мин. При растнрании . листьев больных растений часто употребляют натриево-калийный фосфатный буфер от 0,1 до 0,01М с pH 7, так как большинство вирусов инактивируется при низком значении pH. Кроме того, для стабилизации вирусов в инокулюме применяют такие вещества, как уголь, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия (0,5%), гипосульфит натрия (0,1 %), диэтилдитиокарбамат нат­

рия (0,01М), тиогликолиевую кислоту (0,1%), нико- тин-сульфат, никотин-основание, кофеин, Na-ЭДТА (этилендиаминотетраацетат натрия) и др.

Добавление в инокулюм или на поверхность листа до заражения абразивных веществ способствует более эффективному повреждению листовой поверхности и увеличению таким способом «ворот инфекции». В каче­ стве абразивов рекомендуют использовать карборунд (карбид кремния), корунд (окись алюминия) или це­ лит (диатомовая земля).

Инокулируемые листья натирают легкими движения­ ми поролоновой губки, смоченной в соке. Через не­ сколько минут инокулюм смывают водой из пульвери­ затора или промывалки. После внесения инфекции рас­ тения необходимо поместить в затененное место на 12...24 ч, чтобы они могли лучше перенести последствия травмирования при инокуляции. Наблюдения за инди­ каторами следует начинать через 1...2 дня после зара­

жения и проводить регулярно в течение четырех недель, обращая внимание как на инокулированные листья, так и на молодые, отрастающие. Признаки местной реак­ ции появляются через 3...12 дней после инокуляции, си­ стемной реакции — через 7...30 дней.

Электронная микроскопия. Метод электронной ми­ кроскопии является не только частью комплекса диа­ гностических приемов, но и используется при изучении биологии вирусов, особенностей взаимоотношений с j>ac-

?ейиями и переносчиками, а также при определении концентрации вирионов.

Первая электронная микрофотография вирусов была получена в 1939 г. Г. А. Қауше и Е. Пфанкух при про­ смотре‘очищенных препаратов ВТМ и ХВҚ. Интенсив­ ное применение электронной микроскопии в фитовиру­ сологии началось в 60-х годах нашего столетия, по ме­ ре совершенствования электронно-микроскопической техники и создания микроскопов с высокой разрешаю­ щей способностью.

Принцип устройства электронного микроскопа состо­ ит в следующем. Ток, проходящий через вольфрамовую нить, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Вы­ сокое отрицательное напряжение, приложенное к нити, обусловливает значительную по величине разность по­ тенциалов между нитью и заземленной пластиной ано­ да. Разность потенциалов ускоряет движение электро­ нов по направлению к аноду, при этом часть электронов проходит через отверстие в центре анода (централь­ ную апертуру) и образует электронный луч, направляю­ щийся вниз по колонне микроскопа. Этот луч, сфоку­ сированный первой (конденсорной) магнитной линзой, освещает исследуемый препарат. Основная масса элек­ тронов проходит через объект без отклонения, но часть их рассеивается тяжелыми атомами изучаемого объекта и выбивается из общего электронного луча. Чем плот­ нее структура объекта, тем сильнее рассеиваются лучи. В результате формируется такая структура выходящего луча, которая при повторной фокусировке преобразует­ ся в изображение исследуемого объекта. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй (объек­ тивной) магнитной линзой, которая создает увеличен­ ное изображение объекта. Полученное изображение уве­

В большинстве случаев фотографирование фйтовирусов проводится при их увеличении в 20...50 тыс. раз. При печати фотографии изображение можно еще увеличить в несколько раз.

При просмотре вирусов под электронным микроско­ пом на экране видно слабоконтрастное их изображение в связи с тем, что вирусные частицы вследствие малых размеров почти прозрачны для электронов и слабо их рассеивают. Для того чтобы изображение вирионов бы-

•jio четко видимым, используют контрастирование вирус­ ных препаратов при их приготовлении — напыление ме­ таллом (хром, вольфрам, золото, платина и др.) или так называемое негативное контрастирование с по­ мощью химических соединений (фосфорновольфрамо­ вая кислота — ФВҚ, вольфрамат натрия, молибденово­ кислый аммоний и др.). Негативное контрастирование открывает возможность для изучения внутренней струк­ туры вирусов.

При диагностике фитовирусов необходимо опреде­ лить форму и размер вирионов, для чего следует, как показали исследования ряда авторов, измерить не ме­ нее 100 вирусных частиц. Распределяя затем размеры вирионов по классам, определяют величину, наиболее часто встречающуюся, которую и принимают за типич­ ные размеры исследуемого вируса.

При приготовлении вирусных препаратов в качест­ ве предметных стекол, на которые обычно помещают объект исследования, используют специальные сетки диаметром 2...3 мм (в зависимости от типа микроско­

г о т о в л е н и я в и р у с н ы х п р е п а р а т о в .

Метод погружения. Пригоден для выявления ните­ видных, палочковидных вирусов в листьях, ростках, ко­ журе клубней. Край листа отрезают и место среза по­ гружают на 1— 2 с в каплю дистиллированной воды, на­

несенную на сетку с пленкой-подложкой. Аналогичным образом срезают кожуру клубня или росток (на высоте 7з от клубня) и место среза погружают в дистиллиро­

ванную воду. После высыхания капли препарат контра­ стируют металлом.

Метод разбавленной суспензии. Кусочек листа (1 см2

или 10...30 мг) тщательно растирают в фарфоровой ступ­ ке до получения однородной массы. Затем, продолжая растирать гомогенат, добавляют небольшими порция­ ми 10...20 мл дистиллированной воды. Получается одно­ родная разбавленная взвесь. Капля взвеси наносится на сетку и после высыхания напыляется металлом. Ме­ тод пригоден для стабильных палочковидных и ните­ видных вирусов, имеющих относительно высокую кон­ центрацию вирионов в тканях растения.

Приготовление препаратов лабильных вирусов. Диа­ гностика вирусов, имеющих нестойкие вирионы, сопря­