Маркелова Е.В. Персистирующие вирусные инфекции. этиология и иммунопатогенез

вируса и человека, считается, что ВПГ-1и ВПГ-2 развивались около 8 млн лет. Факторы, которые привели к их возникновению, неизвестны. Но существует теория, что эволюция вирусов отражает эволюцию сексуального поведения человека. Благодаря рекомбинации генов возникли ВПГ-1и ВПГ-2 [178]. На молекулярном уровне разница между этими двумя вирусами заключается в строении двух поверхностных белков-гликопротеинов gC и gG. Вирусы проявляют схожую стратегию инфицирования [114].

Продуктивная ВПГ-инфекция

Альфагерпесвирусы индуцируют слияние клеток путем скоординированного взаимодействия гликопротеинов gB, gD, gH-gL на поверхности инфицированной клетки и рецептора gD на мембране таргетной клетки [261; 257].

Для развития ВПГ-1 инфекции требуется эффективная координация большого числа генов, которая начинается немедленными ранними генами (IE или α) и затем проходит через ранние E или β, в дальнейшем L1 или γ1, с репликацией ДНК и окончательной экспрессией генов L2 или γ2 [188]. Успешная литическая репликация зависит от экспрессии вирусных IE генов внутри всех инфицированных клеток. В эксперименте показано, что применение ингибиторов синтеза белка в период инфекции клеточных культур изменяет аккумуляцию шести мРНКас относительно ICPO (Infected Cell Polypeptide), ICP4, ICP22, ICP27, ICP47, Us1.5, IE генов [191; 186]. Эти гены в дальнейшем определяются присутствием TAATGARDVP16 (цис-регуляторные элементы ранних промоторов ВПГ инфекции). VP16 – основной транскрипционный активатор IE генов. Являясь поздним структурным компонентом вирусного тегумента, в процессе интеграции и снятия оболочки (раздевания) вирусов VP16 высвобождается в цитоплазму [229; 147]. Внутри цитоплазмы VP16 способен связывать протеин клетки хозяина (HCF-1), который содержит порядок последовательностей оснований ДНК, и как результат этой ассоциации VP16 транспортируется в ядра. Внутри ядер две протеиновые формы третичного комплекса с белковосвязывающим доменом хозяина (homeodomein) связывают Oct-1 (octbinging белок 1). Активация домена VP16 в соответствии с важными коактиваторными функциями обеспечивается HCF-1 (host

cell factor), который стимулирует IE транскрипцию и запускает ВПГ-1 литический генный каскад. Таким образом, VP16 служит для увеличения специфической инфекционности вирусной ДНК путем усиления IE генной транскрипции.

Следующее успешное соединение VP16/Oct-1/HCF комплекса с вирусной ДНК активирует аккумуляцию накопления ВПГ-1 E белков, что необходимо для управления транскрипцией вирусных генов во время разрушения экспрессии генов клеток хозяина. На самом деле, за исключением ICP47, все IE белки вовлечены в генную регуляцию. ICPO является полифункциональным белком, который связывает большое количество клеточных протеинов, задействованных в транскрипции, регуляции клеточного цикла, перестройке ДНК, интерферонового ответа [187].

В дальнейшем IE гены выполняют многочисленные и важные функции в стимуляции литической инфекции и уклонения от иммунитета хозяина. Такие функции включают ингибицию трансляции мРНК хозяина путем разрушения РНК, внедрения в ядро вирусной РНК ICP27 и уклонения от распознавания CD8+ лимфоцитами через ICP47 ингибицию TAP (TAP – Transporter for antigen processing) [210; 236]. Таким образом, целью IE генов является развитие активного и устойчивого окружения, в котором будет эффективно функционировать вирусная литическая программа, в качестве триггерного фактора в этом процессе выступает ICPO.

Транскрипция набора колинейных РНК, копированных (транслированных) из очага, в которых повторяются зоны, обрамляющие значительный участок вирусного генома (LATs – Latency Associated Transcript), приводит к продукции 8,3 Кб «мелких» LAT первичных – транскриптов, продуцирущих необычайно стабильный 2.0 интрон, а в дальнейшем – стабильный 1,5 интрон [260]. Эти два образца РНК названы «главные» LATs. Спецификация этих РНК отражает их плотность (численность) и легкость определения в эксперименте. Неэффективно расщепленная структура LATs, образованных во время сплайсинга (вырезания участков РНК), вероятно, объясняет их избыток. Напротив, 8,3 кб мелкий транскрипт и его 6,3 кб иксон трудно определить без более чувствительных методов – клеточной гибридизации или ПЦР в реальном времени. Дефицит этих РНК может потенциально отражать низкий уровень экспрессии или частый процессинг внутри ядер [157]. Множество новейших теорий определило присутствие ряда микро-РНК, хотя ВПГ-1- и ВПГ-2-геномы в большинстве случаев ограничены участком LAT.

В процессе формирования латенции, проходя путь от внешнего везикулярного элемента к нервным клеткам регионального ганглия, герпесвирусы могут трансформироваться в безоболочечные L- и PREP-частицы и в таком виде длительное время персистировать в нервных клетках [5]. Кроме того, ВПГ-1 и 2 имеют консервативный ген-US 3, кодирующий протеинкиназу, необходимую вирусу для выживания в организме человека и обеспечения нейровирулентности [185;200;230]. Внеклеточные стресс-стимулы, включая осмотический шок, приводят к активации JNK (Jun Nterminal kinase)-зависимому пути сигнальной трансдукции, либо клеточной пролиферации или апоптозу клеток, в зависимости от уровня и продолжительности активации JNK [230]. В итоге, ВПГ может продуцировать US3, чтобы блокировать вирус-индуцированный апоптоз нейронов в периферической нервной системе и задержать иммунный ответ [230].

Несколько недавних исследований выявили наличие первичной microRNA (miRNA – ribonucleic acid) в геномах ВПГ-1 и ВПГ-2, подавляющее большинство которых расположено в участках LAT или рядом с ними, а именно в ВПГ-2 закодировано 18 miRNA. Исследования показали, что белок ВПГ-2 miR-H2 может нарушать экспрессию ICPO, а ВПГ-2 miR-H3 и miR-H4 способны разладить экспрессию нейровирулентного фактора ICP34.5. LAT, кодированные miRNA были обнаружены в период скрытого протекания болезни у животных, а также в посмертных тканях людей, но их точная роль в цикле реактивации и латенции неизвестна. ВПГ-2 кодирует несколько генов, которые нарушают индукцию апоптоза во время литической репликации, включая гликопротены gD и gJ, а также протеинкиназу Us3, ICP27 и ICP10. ВПГ-2 преимущественно формирует латенцию и выражает LATs в различные наборы сенсорных нейронов, определяемых клеточными маркерами KH10. Более того, восприимчивые к вторжению вируса A5+ нейроны, по существу, резистентны к проникновению и реактивации ВПГ-1, но способны поддержать продуцирование ВПГ-2 инфекции. Частота бессимптомных генитальных выделений ВПГ-2 возникает в среднем в 25% дней, и такая реактивация проходит в течение 12 часов [236].

Проявление вирусом нейротропизма in vivo и in vitro, а также направленное распространение ВПГ вдоль нервных тканей определяются комплексом вирусных гликопротеинов gE-gI [181]. ВПГ-2 непосредственно поражает эпителий гениталий и реплицируется внутри клеток. Затем он одолевает эпителиальные клетки и клетки других типов, расположенных под слоем инфицированного эпителия. Мигра-

ция ВПГ-2 в периферические чувствительные ганглии сопровождается латенцией вируса. После реактивации вирус вновь реплицируется в эпителии гениталий, проникает в половые пути и может передаваться другим лицам [175]. Таким образом, вирусная транскрипция в период латенции регулируется микро РНК (LAТs). Но не только особенности регуляции вируса важны в поддержании латентного состояния герпеса. Значимую, а, по мнению ряда авторов, ведущую роль в этом процессе играют компоненты врожденного и адаптивного иммунного ответа, включая ИФН- I типа, натуральные киллеры, Т- и В-лимфоциты, NKT-клетки [199; 188; 235; 245; 243; 255; 236].

Реактивация вируса герпеса

Альфагерпесвирусы характеризуются быстрой репликацией вируса и выраженным цитопатическим действием. Вирусы сохраняются в латентном состоянии преимущественно в нервных ганглиях [114]. Предполагают, что в латентном состоянии активными являются лишь гены немедленной ранней и иногда ранней групп генома герпесвирусов. Активация экспрессии генов поздней группы обычно ассоциирована с реактивацией вируса, выходом его из латентного состояния и возобновлением цикла литической репликации. Литическая репликация герпесвирусов оказывает цитопатический эффект на клетку хозяина и приводит к ее гибели [207]. Молекулярные механизмы, обеспечивающие переход ВПГ-2-инфекции в латентное состояние и реактивацию, до конца неизвестны. Полагают, что они аналогичны механизмам, характерным для ВПГ-1 [158; 214]. Недавние исследования (2009) показали, что белок vmw 65 играет ключевую роль в реактивации вируса [205]. Инфекции, такие как ОРВИ и другие, вызывающие лихорадку, также могут привести к рецидивам ВПГ-инфекций. Вероятно, именно из-за этого и возникло понятие «простуда на губах» [99]. К таким факторам относят также воздействие стресса, иммунодепрессантов [171; 241]. Изменения в иммунной системе перед менструацией также могут стимулировать активацию ВПГ-1 и 2 [219]. Другие указанные триггеры включают локальные лицевые повреждения губ, глаз или рта, травмы, хирургические вмешательства, последствия лучевой, фотодинамической терапии, ветра, воздействия УФ-облучения или солнечного света. К основным причинам реактивации рециди-

вирующего генитального герпеса относят: смену полового партнера, присоединение половых инфекций, переохлаждение, стресс, обострение заболеваний мочеполовой системы, беременность и роды [19; 222; 177; 168; 220; 197].

Патогенез герпетической инфекции

Вирус герпеса не способен проходить через неповрежденный роговой слой кожи, что обусловлено отсутствием на нем специфических рецепторов. Вирус способен проникать и размножаться в кератиноцитах, эпителиальных клетках, нервной ткани [32; 6; 18; 42; 161; 144; 147; 180; 195], лимфоцитах, дендритных клетках и нейтрофилах [82;213; 196; 218; 160; 182]. Герпес передается при прямом контакте поврежденных покровов с пораженными участками кожи или с биологическими жидкостями инфицированного человека. Передача осуществляется между дискордантными партнерами: переболевший человек (ВПГ-серопозитивный) может передать вирус серонегативному здоровому человеку [241; 236]. В эксперименте было показано, что ВПГ-1 можно выделить из кожи при латентном течении инфекции [203]. После контакта с источником инфекции вирусные частицы, попавшие на эпителий, движутся с небольшими перерывами через кожные или слизистые оболочки рта или гениталий. Вирус проникает в клетки через рецепторы, такие как nectin-1 и 2, HVEM (herpes virus entry mediatоr) и 3-0 сульфатированный гепаран-сульфат [251; 246; 258; 216; 266; 263]. Установлены и другие механизмы распознавания ВПГ-клетками. Это клеточные поверхностные рецепторы TLR 2, TLR 3, TLR 9 [110; 193; 246; 148; 258; 223], а также ряд цитоплазматических рецепторов – среди них RiG I (retinoic acidinducible gene) и MDA 5 (Melanoma Differentiation-Associated protein), которые распознают вирусные микро RNA (ribonucleic acid) и активируют NF-кВ (nuclear factor kappa В) и IRF 3 (Interferon regulatory factor), регулируя экспрессию ИФН-α/β и провоспалительных цитокинов [251; 159; 243]. Внешняя оболочка вируса сливается с клеточной мембраной. Далее, вирусный нуклеокапсид оказывается в нейроплазме, где и происходит высвобождение вирусной ДНК. Она транспортируется по дендритам нервных окончаний в тело чувствительного нейрона, находящееся в сенсорном ганглии, где встраивается в его генетический аппарат навсегда [264; 230]. После проникновения вируса начинается процесс

его активного воспроизводства в клетке – персистенция [215; 162; 208; 166; 157; 210; 236]. При лабиальных поражениях характерна персистенция вируса в нейроцитах чувствительных ганглиев тройничного нерва, а при генитальных – в поясничных [165; 233; 209].

Таким образом, после первичного заражения вирус герпеса навсегда встраивается в геном клетки-хозяина и никогда не будет элиминирован иммунной системой. Он входит в нервные окончания в коже и перемещается по ним в чувствительный нейрон, расположенный в ганглии, где переходит в латентную стадию. Носительство чаще всего продолжается в течение первых 12 месяцев после инфицирования. Продолжительность такого носительства при иммунодефицитах (например, при ВИЧ-инфекции) длительнее [145]. У большинства людей воспроизводство и выделение вируса сразу после инфицирования проходит бессимптомно. Это может состояться более чем за неделю до или после появления первых симптомов в 50% случаев. Возбудитель интенсивно размножается, запуская литический, продуктивный тип инфекции. Возникает очаговая дегенерация эпителия: клетки увеличиваются в размерах, затем погибают, образуя очаги некроза [80; 6; 42; 149; 143].

После заражения организм начинает синтезировать антитела против конкретного ВПГ-типа вируса, предотвращая распространение инфекции. В случае заражения вирусом ВПГ-1-типа такая сероконверсия (выработка антител) может защитить организм от прочих инфекционных процессов, вызываемых этим вирусом, таких как генитальный герпес, герпетический кератит и панариций [131;132; 156; 176]. Вероятно, антитела, выработанные при заражении ВПГ-1 типом вируса, облегчают симптомы при последующем инфицировании ВПГ-2 типа, однако, даже асимптоматический больной все еще продолжает быть заразным [210]. Многие отмечают тот факт, что предварительная иммунизация вирусом ВПГ-2 также облегчает симптоматику у людей, заразившихся вирусом ВПГ-1 типа. Инфицирование вирусом ВПГ-2 часто протекает бессимптомно, хотя возможность передачи может сохраняться длительное время [156; 176]. При первичном инфицировании образуются IgM-антитела, при рецидивах – IgG и IgA. Вследствие персистенции вируса у инфицированных людей иммунитет становится нестерильным и временным – при снижении иммунитета, особенно дефиците естественных киллеров (NK-клеток, NKТ-клеток) наступает рецидив [99; 101; 102; 115; 86; 83]. В настоящее время накоплено много факторов, свидетельствующих о том, что обязательным этапом в патогенезе герпетической инфекции является

вовлечение нервных ганглиев, в которых НSV персистирует пожизненно. Нервные ганглии рассматривают как резервуар НSV, обеспечивающий последующие рецидивы [156; 144; 147; 140]. В то же время механизмы латенции НSV (гипотезы персистенции субвирусной структуры, интеграции вирусного генома в клеточный геном и др.) и реактивации латентной инфекции (гипотезы статического и динамического состояния вируса) окончательно не выяснены [107;99]. После стадии активной инфекции вирус остается латентно персистировать в чувствительных ганглиях и ганглиях автономной нервной системы. Двухцепочечная нить вирусной ДНК встроена в геном клетки, расположенный в ядре нейроцита. Вирусных частиц в этой фазе не производится. Длительность периодов латентности и выраженность клинических симптомов при реактивации инфекции зависят от возможностей иммунной системы организма контролировать активность репликации вируса [99; 119; 53]. Существует ряд доказательств, что наследственность влияет на частоту рецидивов. В области 21-й хромосомы есть зона, включающая 6 генов, которую связывают с частотой рецидивов [217; 216; 221].

Персистенция вируса

Способность к длительному персистированию обуславливается наличием у герпесвирусов многочисленных механизмов, воздействующих на формирование противовирусной иммунной защиты и проводящих к уклонению патогенов от иммунного надзора [254; 191]. Описано несколько таких молекулярных механизмов: ВПГ связывает и анактивирует молекулы комплекса (С3в, С5в) с помощью gС оболочки вируса, угнетает транскрипцию ИФН-стимулированных генов и процесс фосфорилирования Jаk 1 (Janus kinase), а также STAT 2

(transcription factor belonging to the Signal Transducer and Activator of Transcription protein family), блокируя каскад событий, вызываемых ИФН-индуцированным сигналом, инактивируя IgM [229; 238]. A. Svensson et al. (2012) [252] при исследовании 228 ВПГ-2-позитивных людей обнаружили, что генетические вариации в гене STAT4 были связаны с бессимптомной ВПГ-2 инфекцией, а также с увеличением в пробирке секреции ИФН-γ. Взаимовоздействие с гликопротеидами вирусной оболочки gE и gI приводит к презентации вирусных анти-

генов в комплексе с HLA I типа и апоптоза инфицированной клетки за счет связывания ICPO с белком р52 [204; 263]. LATs ВПГ-1 ингибирует функциональную активность дендритных клеток [196; 253]. Кроме того, одним из механизмов персистенции вируса является стимуляция синтеза «неэффективных» IgG-антител, которые супрессируют иммунитет, подавляют NK-клетки, усиливают продукцию ММР-9 (Matrix MetalloProteinases) [198; 206]. Индуцированное вирусами угнетение иммунной защиты позволяет им благополучно размножаться и распространяться в организме хозяина в течение длительного времени. ВПГ может стимулировать активацию иммунного ответа через поверхностные TLR 2 (Toll-like Receptor), которые экспрессируются на миелоидных дендритных клетках (DCs) и NK-клетках. NK клетки инфильтрируют ткани, пораженные ВПГ. M. Kim с соавт. (2012) [194], изучая механизмы иммунного контроля ВПГ инфекции, показали, что ВПГ антиген прямо активирует NK через TLR 2, таким образом облегчая его презентацию СD4+лимфоцитам [194]. А около 57% NK прямо контактируют с СD4+ Т-лимфоцитами в дерме при герпетической инфекции [194]. ВПГ-1/ВПГ-2 снижает экспрессию HLA I (Human Leucocyte Antigens) класса на кератиноцитах, что нарушает процессы распознавания вируса СD8+ лимфоцитами [164]. Установлено, что функциональный полиморфизм TLR-3 L412F ассоциирован с рецидивирующей лабиальной герпетической инфекцией [154]. ВПГ характеризуется выраженной транскрипцией набора колинейных РНК, копированных (транслированных) из очага, в которых повторяются участки, обрамляющие значительный пласт вирусного генома во время скрытого течения вируса. Предыдущие исследования показали, что латентная вирусная нагрузка и CD8+ Т-клетки в ганглиях воздействуют на частоту реактивации ВПГ. Хотя LAT важна для эффективной реактивации и установления латенции, непонятно, как LAT влияет на ВПГ латентную вирусную нагрузку или проникновение CD8+ Т-клеток в ганглии. Y. Hoshino et al. (2009) [211] провели исследование, в котором заразили мышей LAT-дефицитным ВПГ или LAT-содержащим ВПГ-2 и обнаружили, что пониженное число ex vivo реактиваций LATдефицитного вируса не связано с повышенным содержанием CD8+ Т-клеток в ганглии. Число реактиваций LAT-дефицитного вируса было меньше, чем LAT-содержащего, даже когда латентные вирусные нагрузки были сравнимы. Это означает, что различия в реактивации неполностью зависят от латентной вирусной нагрузки, поэтому, скорее всего, LAT имеет дополнительные функции, важные для реактивации [211].

Роль иммунной системы

По мнению Н.Б. Серебряной (2005) [102], развитие рецидивов заболеваний связано с дисфункцией иммунной системы [102]. Известно, что первая линия защиты представлена компонентами врожденного иммунитета [118; 127]: происходит приток полиморфно-ядерных лейкоцитов, дендритных клеток и моноцитов, фагоцитируюших ВПГ и секретирующих противомикробные пептиды (ПМП). ПМП, являясь катионными белками, секретируются активированными фагоцитами и эпителиальными клетками. Описано инактивирующее действие двух больших классов ПМП (дефенсинов и кателицидинов) на вирусы простого герпеса 1 и 2, цитомегаловирус и другие [47; 117; 139]. Однако, ВПГ оказывает цитопатическое действие на клетки, в которых размножается, последние также приобретают новые антигенные свойства и могут стать объектом атаки Т-киллеров [2]. Филогенетически более древний механизм антигенспецифического иммунного ответа опосредован Т-клетками [117; 139]. Этот механизм реализуют СD8+ Т-лимфоциты, он наиболее важен при вирусных инфекциях, так как вирусы герпеса, заражая эпителиальные клетки и размножаясь в них, экспрессируют свои вновь синтезированные пептиды на клеточной поверхности. В результате этого инфицированные клетки приобретают способность представлять вирусный антиген Т-лимфоцитам- хелперам и, одновременно, становятся мишенью для цитотоксических СD8+ клеток [164; 166; 244]. Антитела классов IgM, IgG2 и IgG1 наряду с СD8+ лимфоцитами играют важную роль в формировании иммунитета против герпесвирусов [97; 54; 28; 162]. Противогерпетические антитела IgА синтезируются с 7-го дня после контакта клеток иммунной системы с антигеном. IgM-антитела улавливают свободные вирионы, покрывают их поверхность, тем самым способствуя распознаванию вирионов фагоцитирующими клетками и цитотоксическими лимфоцитами (СD3ˉСD8+; СD3ˉСD16+СD56+). IgM-антитела синтезируются с 14-го дня после инфицирования. При первичной инфекции наблюдается нарастание титра IgМ или их постоянство на фоне отсутствия IgG. С 4-й недели после инфицирования регистрируется подъем титра антител преимущественно за счет синтеза IgG. Однако роль IgG в патогенезе ВПГ-инфекции трактуется неоднозначно [107; 115]. Показано, что кроме собственно нейтрализующего эффекта, IgG-ВПГ иммунные комплексы стимулируют продукцию провоспалительных медиаторов (ИЛ-8, ММР-9, LТВ-4) [167; 206], что может усиливать воспаление

и выраженность клинических проявлений. ИЛ-8 также может индуцировать секрецию ММР-9 из нейтрофилов двумя путями: включая протеинкиназу С и внеклеточную киназу ERK 1.2 и другие семейства киназ [139; 167; 171; 183; 189]. В экспериментальной работе K. Hayshi с соавт. (2009) показано, что иммунные комплексы ВПГ с IgG стимулируют макрофаги через Fc рецепторы и ТLR 2 и 3 типов, индуцируя продукцию ММР-9. Провоспалительные цитокины (ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α) также усиливают продукцию ММР-9 [202], избыток ММР-9 участвует в распространении вируса и прогрессировании болезни.

В последние годы опубликованы данные о значимой противовирусной роли других клеток, относящихся к субпопуляции NKТ с иммунофенотипом СD3+СD16+СD56+ [150; 192] и являющихся основными продуцентами ИФН-γ на первом этапе реакций на внедрение патогена [139]. ИФН-α/β и ИЛ-12 способствуют поляризации иммунного ответа по Th 1 типу и выработке СD4+ и СD8+ лимфоцитами ИФН-γ [52; 97; 37; 57; 118]. ИФН-α и ИФН-γ синергично ингибируют ВПГ инфекцию в кератиноцитах после выхода из терминальных аксонов [228]. ИФН-γ играет важную роль при ВПГ инфекции. Известно несколько механизмов: ИФН-γ стимулирует экспрессию НLА II класса на кератиноцитах, облегчая распознавание вируса СD4+ лимфоцитами [205]. Он также индуцирует HLA I на СD8+ лимфоцитах для распознавания и уничтожения зараженных клеток. По мнению ряда авторов, вирус простого герпеса способен снижать ответную реакцию клеток на ИФН-γ. Это происходит из-за нарушения фосфорилирования основных молекул интерфероного пути STAT I и YaK 1, 2, NF-кВ, что вероятно, приводит к недостатку стимулированной продукции ИЛ-12р70 [221]. Известно, что ФНО-α подает сигнал смерти через рецептор ФНО-α 1 типа (р55) и Fas-антиген (Аро-1, CD95+), инициирующие взаимодействие смертельных доменов рецептора с адаптерными протеинами FADD (FasRassociated death domain) и TRADD (ФНО-R-associated death domain) и каспазой-8 [54; 139]. Достаточно низкое содержание ФНО-α, необходимого для запуска апоптогенного сигнала, косвенно свидетельствует о нарушении апоптоза. Дефект апоптоза является одной из причин сохранения жизнеспособности инфицированных вирусом клеток, что приводит к хронизации процесса [111]. Этому способствует также и недостаточная выработка ИЛ-2 [163]. ИФН-α и ИФН-β тормозят репликацию вируса, препятствуя экспрессии α-генов [24; 89; 115; 19; 15; 35]. М.А. Самгин и А.А. Халдин (2002) [99] сделали вывод о том, что ИФН-γ и степень функциональной активности естественных киллеров служат наиболее важными причинами, контролирующими ла-