Кузнецова Л.В., Бабаджан В.Д., Харченко Н.В. та ін. Імунологія

(HLA - антигени). HLA - human leucocyte antigens - антигени тканинної сумісності (cінонім: MHC - major histocompatibility complex - головний комплекс гістосумісності). Кожна людина володіє індивідуальним набором HLA - антигенів.

Молекули HLA виконують роль своєрідних "антен" на поверхні клітин, що дозволяють організму розпізнавати власні і чужі клітини (бактерії, віруси, ракові клітини і т.д.) і при необхідності запускати імунну відповідь, що забезпечує вироблення специфічних антитіл і видалення чужорідного агента з організму.

Склад кожного антигену HLA кодується відповідним HLA-геном 6-ї хромосоми. Інакше кажучи, індивідуальне поєднання HLA-антигенів у конкретної людини визначається індивідуальним поєднанням HLA-генів. Поєднання HLA генів, що отримуються від батьків, настільки ж індивідуально, як і відбитки пальців. HLA-гени успадковуються по кодомінантному типу, тобто одну хромосому дитина успадковує від матері, а іншу - від батька. Таким чином, у людини два гаплотипи і кожна клітина організму несе на собі диплоїдний набір антигенів, один з яких успадковується від матері, а інший - від батька. Виняток становлять статеві клітини (яйцеклітина і сперматозоїд), кожна з яких містить в своєму ядрі тільки по одному гаплотипу.

Антигени гістосумісності, що виявляються на клітинах конкретної людини, складають HLA-фенотип цієї людини. Для його визначення необхідно провести фенотипування клітин індивіда. Як правило, "типуються" лімфоцити периферичної крові. Щоб встановити гаплотипи обстежуваного і, відповідно, його генотип - послідовність розташування генів у хромосомі, необхідно провести типування батьків.

Гени, що кодують HLA розташовані в 7-ми областях (локусах) 6-ої хромосоми: HLA-A, B, C, D (фактично, складається з 4 локусів: власне HLA-D і HLA-DP), DQ, DR.

Кожен з генів може мати багато десятків варіантів (алелей) - їх різноманітні поєднання і формують безліч комбінацій генів. Саме алелі, виявлені при дослідженні, вказуються в бланку результатів HLA-типування.

Виділяють 2 класи антигенів HLA. До класу I відносяться антигени локусів A, B і C, а до класу II - антигени локусів DR, DP і DQ. Антигени класу I присутні на поверхні всіх клітин (а також - тромбоцитів), антигени класу II - на поверхні клітин, що беруть участь в імунологічних реакціях (B-лімфоцитів, активованих T-лімфоцитів, моноцитів, макрофагів і дендритних клітин).

Гени HLA позначаються тими ж літерами, що і закодовані ними антигени HLA. Назви генів і антигенів HLA складаються з однієї або декількох літер і цифр, наприклад A3, B45, DR15, DQ4. Буква позначає ген (область і локус), а цифри - алель цього гену, при цьому цифрові позначення присвоюються в міру відкриття нових алелей.

Поза вагітністю імунні клітини, що циркулюють в організмі, вистежують на поверхні клітин білковий код - білки тканинної сумісності. І якщо виявляються клітини зі зміненою структурою (це занесені мікроби або змінені клітини самого організму), організм негайно видає імунну відповідь - атипові клітини знищуються.

При спадкуванні антигенів тканинної сумісності дитина отримує по одному гену кожного локусу від обох батьків, тобто половина антигенів тканинної сумісності успадковується від матері і половина від батька. Таким чином, дитина є наполовину чужорідним для організму матері. Невідповідність подружжя за HLA-антигенів і відміну клітин плоду від материнського організму є нормальним фізіологічним явищем, необхідним для збереження і виношування вагітності. Ця "чужорідність" запускає імунологічні реакції, спрямовані на збереження вагітності.

При настанні вагітності з лімфоцитів ендометрію формується клон імунних клітин, що виробляє спеціальні "захисні" (блокуючі) антитіла, проти батьківських HLA-антигенів. Ці антитіла блокують HLA-антигени батька від ефекторних клітин імунної системи матері, вони захищають плід від материнських природних кілерів, що сприяють відторгненню ембріона. "Блокуючі" антитіла до батьківських HLA-антигенів (вони називаються APLA - anti pater leukocytes antibody), експресуються лімфоцитами ендометрію. APLA виявляють уже на 5-му тижні вагітності. APLA-антитіла виробляються при антигенних відмінностях подружжя за HLA-системі II класу. Тому під час вагітності плід і його клітинні структури невиразні для імунної системи материнського організму.

Лімфоцитотоксичний тест

До теперішнього часу в більшості лабораторій HLA-A. В, С і DRантигени визначають за допомогою серологічних методів, зокрема, лімфоцитотоксичного тесту. Цей тест заснований на здатності анти-НLА- антитіл у присутності комплементу руйнувати лімфоцити, що несуть відповідні антигенні детермінанти. Загибель клітин демонструється за допомогою додавання трипанового синього. При цьому мертві, пошкоджені клітини фарбуються, і під мікроскопом вираховується їх кількість.

Мікролімфоцитотоксичний тест є модифікацією лімфоцитотоксичного тесту. Для його постановки використовують всього лише 1 мкл типуючих сироваток, а також невелика кількість клітин. Мікролімфоцитотоксичний тест є стандартним і використовується у всіх типуючих лабораторіях світу. Набір типуючих сироваток (типуюча панель) створюється в результаті досліджень із зразків сироваток, що містять анти- НLА-антитіла. Ці антитіла можуть індукуватися під час вагітності, при гемотрансфузіях, а також в результаті пересадки алотрансплантатів. Основними продуцентами типуючих сироваток є жінки, що багато народжували, які імунізуються HLA-продуктами чоловіка під час виношування плоду.

Для виявлення класичних антигенів системи HLA локусів А, В, С

іDR використовується спеціальні антисироватки, що містять антитіла до вказаних антигенів. Найбільш поширеними є 2 види серологічних реакцій мікролімфоцитотоксичності для серологічного HLA-типування: 1) HLA-типування на планшетах Terasaki методом мікролімфоцитотоксичності (CDC) та 2) визначення HLA антигенів методом ELISA з використанням Lambda Monoclonal Trays.

1). Комплемент-залежний мікролімфоцитотоксичний тест Lambda Cell Tray™ (LCT™) призначений для скринінгу сироватки на наявність HLA антитіл I і II класу в комплемент-залежному лімфоцитотоксичному тесті. Набори Lambda Cell Tray™ 30Т, 60т і 72Т призначені для скринінгу

івизначення специфічності HLA антитіл I класу. Набір Lambda Cell Tray™ 60В призначений для визначення специфічності HLA II класу.

Принцип методу. Лімфоцити, що несуть відомі антигени на поверхні, інкубують із зразком сироватки та кролячим комплементом. У разі, якщо сироватка містить специфічні антитіла до цих антигенів, запускається процес лізису клітини. Якщо дослідна сироватка містить HLA антитіла, то вони можуть бути визначені.

LCT™ Lambda Cell Tray™ являє собою заморожену клітинну панель, розроблену для визначення рівня PRA і скринінгу HLA антитіл. LCT™ пропонує різноманітну клітинну панель для цитотоксичного скринінгу антитіл в людській сироватці. Планшети складаються із заморожених

впланшеті Терасакі відібраних лімфоцитів.

2)ELISA тест з використанням планшет Lambda Antigen Tray ™ (LAT) Призначений для визначення HLA-специфічних антитіл в сироватці

у реципієнтів до і після трансплантації. Характеризується високою специфічністю - в наборах LAT™ використані очищені антигени HLAI і II класу. Набір LAT™ розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла не зв'язані з комплементом, дозволяє розрізнити специфічність HLAI і II класу, визначає IgG і IgM антитіла, включає антигени рідкісних алелів HLA.

Принцип методу LAT ™ - це пре-калібровані реагенти ELISA для визначення IgG антитіл до молекул HLAI і II класів в людській сироватці. Певні кількості HLA антигенів, очищених методом афінної хромотографії, нанесені в різні лунки планшета Терасакі. Специфічне зв'язування антитіл з тестованого зразка з будь-яким з цих антигенів виявляють за допомогою антитіл, кон'югованих з лужною фосфатазою, які дізнаються тільки людські IgG. Кількісні визначення ступеня реакції визначають спектрофотометрично, після додавання відповідного хромогенного субстрату. Якісні визначення специфічності антитіл визначають шляхом аналізу LAT ™ карти реактивності з використанням відповідних LAT ™ робочих таблиць.

LAT™ планшети з антигенами Lambda (Lambda Antigen Trays™, LAT™) є очищені комплекси HLA класу I і II, нанесені на планшети Терасакі, і призначені для визначення HLA IgG антитіл. При додаванні сироватки пацієнта, антитіла зв'язуються з очищеними HLA антигенами. Панель HLA антигенів дозволяє реєструвати зв'язаний і не зв'язаний комплемент IgG антитіла.

LAT™ Mixed метод з використанням планшетів зі змішанням анти- генами-метод попереднього скринінгу HLA антитіл, який дозволяє тестувати кілька зразків на одному планшеті. Планшети LAT ™ Mixed містять певний набір HLA антигенів, включаючи рідкісні, і розпізнає як цитотоксичні антитіла, так і антитіла, що не зв'язуються з комплементом.

LAT™ Single Antigen метод з використанням одного антигену - це метод для реєстрації та визначення типу HLA антитіл в пацієнтах з високим рівнем PRA. Всі лунки планшет Терасакі для LAT ™ Single Antigen покриті однаковими антигенами. LAT ™ SingleAntigen визначає антитіла зі слабкою специфічністю, які можуть бути не виявленими іншими методами на тлі антитіл проти антигенів, що представлені в більшій кількості. За допомогою панелі очищених антигенів HLA точно ідентифікується специфічність антигенів у сироватці з високим рівнем PRA.

Молекулярне HLA-генотипування

Раніше, коли основним об'єктом дослідження служили тільки антигени системи HLA, уявлення про комплекс генів HLA могли формуватися

восновному на аналізі непрямих даних, що включають вивчення антигенів системи HLA в популяціях, сімейному аналізі, реакціях, субстратом яких були HLА-антигени. Тепер, завдяки розвитку молекулярної генетики та імунохімії, з'явилася можливість не тільки проводити тонкий аналіз HLA-антигенів, а й вивчити самі гени HLA. Особливий прогрес у цьому напрямку було досягнуто після відкриття і впровадження в дослідження в галузі вивчення необхідні для досліджень ділянки ДНК, які,

всвою чергу, відкрили широкі можливості для швидкого і точного аналізу молекулярного поліморфізму HLA.

Молекулярне HLA генотипування за допомогою методу ПЛР виявляє різні алелі HLA на рівні ДНК. Це дає можливість визначати ті алелі генів HLA класу II, які важко виявити за допомогою серологічного типування, або зовсім не можливо. Так, наприклад, за допомогою серологічної техніки в локусі DR виявлено 14 антигенів, а за допомогою ДНК-типу- вання - понад 100 алелів. HLA-фенотип записують, дотримуючись числового порядку HLA-антигенів, згідно з номенклатурою. Наприклад: HLA-фенотип суб'єкта-Al, 2; B5, 12; DR2, 5; DQ3, 4.

Встановлення нових алелів змусило переглянути номенклатуру HLA, і тепер прийнято чотиризначне їх позначення (наприклад А0101 замість А1). В тих же випадках, коли виявлено декілька алелів, які за колишньою класифікацією кодували різні субтипи одного антигену (наприклад,

вHLA-A2 було визначено 12 таких субтипів), їх позначають як різні алелі, що мають загальні перші цифри. Наприклад, від HLA0201 до HLA0212 або від HLAB2701 до HLAB2707.

Якщо в результаті типування визначається тільки один антиген по якомусь локусу, то це є наслідком гомозиготності індивіда з даного гену. Отже, від батька і матері успадкована алель однаковою специфічності.

Вищевикладене стосується тільки класу I HLA, де поліморфним є тільки один ланцюг. У класі II HLA через можливий поліморфізм як бета, так і альфа генів, встановлені алелі позначають в залежності від ланцюга, що несе варіабельну ділянку ДНК, що визначає специфічність, наприклад DQA1-0501 і DQB1-0501.

Існує декілька методик проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

SSP (sequence specific primer) - найбільш поширена і технічно проста методика, коли кожному алельному варіанту або групі алелей відповідає своя пара праймерів. Детекція результатів ампліфікації відбувається методом електрофорезу в гелі. Інтерпретація результатів HLA-типування зводиться до однозначного так/ні - присутність або відсутність продуктів ПЛР.

SSO (sequence specific oligonucleotide) - неспецифічна ампліфікація досліджуваної ділянки (локусу) ДНК з подальшою специфічною гібридизацією з міченими ДНК-зондами.

SBT (sequence-based typing) - метод, який застосовують для HLA - генотипування і визначення послідовності ДНК-мішені de novo (тобто для секвенування невідомої послідовності ДНК). Для здійснення SBTтехнології HLA-генотипування використовують набори реагентів ConsenSys SBT для зчитування послідовностей ампліфікованої ДНК, отриманих в результаті генотипування реагентами LABType SSO. В набори ConsenSys SBT входять праймери для секвенування і два буфера для промивки.

Всі методи HLA-генотипування припускають наявність 3х етапів: I етап - виділення ДНК, II етап ампліфікація і III етап - детекція результатів ампліфікації.

Для проведення аналізу береться кров з вени і з отриманого зразка виділяють лейкоцити (клітини крові, на поверхні яких найбільш широко представлені антигени тканинної сумісності). HLA-фенотип визначається методом полімеразної ланцюгової реакції. ПЛР є високоточним методом, його достовірність сягає 98%.

Реакція ампліфікації ДНК in vitro заснована на здатності молекул нуклеотидтрифосфатів в присутності ДНК-полімерази при відповідних умовах (рН, іонна сила розчину, температура) утворювати на матриці (одноланцюговою ДНК) комплементарний ланцюг. Необхідною умовою синтезу є наявність праймера - олігонуклеотиду, який синтезується штучно.

Для підвищення точності реакції і збільшення чутливості, як правило, використовують пару праймерів. Управління ходом реакції йде за допомогою зміни температурних умов. При певній температурі (залежить від нуклеотидного складу ДНК) йде розбіжність подвійного ланцюга ДНК - плавлення. Зниження температури призводить до зворотнього процесу - з'єднанню комплементарних ланцюгів - отжигу. При надлишку праймерів в розчині ймовірність відпалу на ДНК-матриці праймера набагато вища, ніж приєднання повного ланцюга. І, оскільки праймер менше матриці,

починається активне добудовування (синтез) комплементарного ланцюга. Швидкість добудови досягає декількох сотень (іноді більше тисячі) нуклеотидів в секунду. Таким чином, наприкінці циклу є подвоєний набір ДНК (точніше не всієї ДНК, а ділянки, обмеженого праймерами). Знову підвищується температура - плавлення - відпал - синтез - і в розчині вже 4 копії вихідної матриці. Кількість копій (ампліфікатов) зростає в геометричній прогресії, і після 30-40 циклів у розчині знаходиться від 10 млн. до 10 млрд. копій вихідної матриці. Причому, оскільки є пара праймерів, ампліфікати будуть строго певного розміру. Така кількість ДНК можна візуально виявити, наприклад, при електрофорезі на агарозному гелі з бромідом етидію.

Технологія SSР (Sequence Specific Primers) базується на ПЛР з використанням алель-специфічних праймерів, "уловлюючих" шукані HLA ділянки ДНК з подальшою детекцією методом гель-електрофорезу.

Етапи технології:

1.Виділення ДНК з досліджуваного зразка крові, кісткового мозку або тканини (від 15 хв. до 2 год., в залежності від методу).

2.ДНК ампліфікація (45 хв. - 1,5 год.). ДНК розкапується в лунки ПЛР планшету, кожна з яких містить праймери певної специфічності. Кількість лунок (ПЛР реакцій) відповідно визначається кількістю типованих локусів і кількістю алельних варіантів в кожному локусі. Так, наприклад, для типування локусу DR з низьким дозволом (скринінгового HLA-типування) зазвичай визначають близько 24 специфічностей (24 лунки ПЛР планшета).

3.Електрофорез (20-30 хв.). Амплікон переносяться в лунки агарозного гелю. У тих лунках, де специфічності праймерів збіглися зі специфічними ділянками ДНК, з'являється смуга продукту в гелі.

4.Аналіз результатів. По таблиці інтерпретації або за допомогою програми визначають, якій HLA-алелі відповідає смуга продукту.

Переваги SSP технології: здійснює типування як на низькому, так і на високому рівнях; визначає точковий алельний поліморфізм, практично порівнянний з секвенуванням.

Основний недолік - низька продуктивність. У 96-лунковий термоциклер при низькорівневому типуванні можна помістити лише один зразок (DRлокус - 24 пробірки, А-локус - 24 пробірки, В-локус - 48 пробірок). Час, витрачений таким чином на типування одного зразка, наприклад, по А, В, DR від виділення ДНК до інтерпретації результатів складе приблизно 3 год. За день можна протипувати 2-3 людини.

SSP технологію можна рекомендувати для HLA-лабораторій, що використовують як низько-, так і високорівневе типування, і з середнім навантаженням до 5-7 чоловік на тиждень: трансплантологічних відділень, клінік пересадки кісткового мозку, клінік та інститутів, що виявляють генетичні захворювання.

Технологія SSO (sequence specific oligonucleotide) включає етапи ПЛР з наступною детекцією шляхом гібридизації ампліконів з олігонуклеотидними зондами.

Етапи технології:

1.Виділення геномної ДНК аналогічно SSP технології.

2.Ампліфікація зразка відбувається в одній ПЛР пробірці, тобто не утворюються «специфічні» HLA амплікони, а утворюється загальна геномна ДНК зразка (45 хв. - 1,5 год.).

3.Блот-гібридизація являє собою процес зв'язування (кон'югації) тепер уже специфічних ділянок ДНК з олігонуклеотидними зондами, пришитими на спеціальні нейлонові смужки - стрипи. Незв'язані ділянки ДНК відмиваються, а кон'югований фрагменти, відповідні HLA аллелям, фарбуються пероксидазою (1,5 - 2:00).

4.Інтерпретація результатів за допомогою спеціального обладнання. Переваги SSO технології: здатність до повної автоматизації; чутли-

вість системи дозволяє виявити точкові мутації генів HLA; спеціальна технологія зондів (можливе визначення поліморфізму двох або більше зчеплених генів на одному ланцюгу ДНК; зниження числа повторних типувань за рахунок відсутності неоднозначних результатів, які утворюються при звичайному типуванні); постгібридизаційна стабільність (одночасна обробка результатів кількох проб); ампліфікація для типування кожного локусу в одній пробірці (визначення локусів A, B, C, DRB1, DRB3, 4, 5, або DQB1 в одній пробірці); висока продуктивність; мінімізація похибок генотипування за рахунок одного процесу ампліфікації; час детекції кожного зразка менше 1 хвилини; на відміну від методу SSP час дослідження займає приблизно 2 год.

Основний недолік SSO технології з її допомогою не можна проводити HLA - типування на високому рівні. Максимальна роздільна здатність від низького до середнього рівня. Тому при необхідності проводити типування на високому рівні лабораторія повинна мати додаткову систему для електрофорезу.

SSO технологія рекомендується: кріо-сховищ пуповинної крові; регістрів донорів кісткового мозку; великим трансплантологічним центрам; онкологічним центрам.

HLA-генотипування методом секвенування. Технологія SBT секвенування є останнім етапом молекулярного аналізу попередньо-виділе- ного, ампліфікованого і протестованого простішими методами фрагмента ДНК. Секвенування являє собою визначення нуклеотидної послідовності фрагмента ДНК шляхом отримання серії комплементарних молекул ДНК, що розрізняють за довжиною на одну підставу.

Для здійснення SBT технології HLA-типування лабораторія повинна мати у своєму розпорядженні додатково секвенатор.

Етапи технології:

1.Гібридизація досліджуваного фрагменту ДНК з праймером.

2.Ферментативний синтез ДНК.

3.Денатурація отриманих продуктів формамід (в результаті утворюються унікальні олігонуклеотидні послідовності, які розрізняються по довжині і містять праймер).

4.Електрофорез в поліакриламідному гелі на чотирьох доріжках (за числом типів нуклеотидів).

6.Аналіз результатів на радіоавтографі.

Переваги SBT технології: «золотий стандарт» HLA типування; повна інформація про сиквенси; секвенування високого рівня (до 4-го знака); можливість детекції нових алелів; можливість адаптації до великих лабораторних потоків.

Реагенти Abbott Molecular дозволяють використовувати стратегію гетерозиготного секвенування: типування алелей HLA-антигенів з високим дозволом, включаючи ПЦР-ампліфікацію і секвенування з флуоресцентною ДНК;

Особливості: 1 локус-специфічна ПЛР; типовані локуси: HLA-A,-B,-C, -DRB1,-DQB1,-DPB1; включений набір праймерів для «грубого» секвенування; програмне забезпечення здійснює аналіз і підказує подальші кроки для уточнюючого секвенування; для дозволу невизначеностей використовуються HARPs (Hemizygous Ambiguity Resolution Primer).

Клінічне значення HLA-типування та генотипування

Послідовність етапів генотипування із застосуванням різних технологій при підборі донора для трансплантації повинна виглядати таким чином:

1) генотипування великої кількості зразків за технологією rSSO зі середньовисоким рівнем для звуження кола можливих донорів;

2)генотипування за технологією SSP для розрішення неоднозачностей, отриманих при генотипуванні методом SSO;

3)генотипування з високим розрішенням реципієнта і донора з застосуванням наборів LABType SSO HD і LABType SSO HLA Exon 4-7 Supplement для отримання алельного рівня (аналогічний рівень досягається при секвенування);

4)визначення рівня серопозитивності донорів та реципієнта; Моніторинг рівня посттрансплантаційних антитіл і профілю специ-

фічності антитіл до антигенів HLA.

Необхідно застосовувати всі технології HLA-типування. Технології SSO і SSP не конкурують, а доповнюють один одного.

Показання до призначення аналізу:

•Типування генів HLA II класу застосовується для діагностики деяких форм безпліддя і невиношування вагітності, які можуть бути наслідком високої гомології генів HLA II класу в подружній парі при повній фертильності партнерів.

•Типування генів HLA II класу є обов'язковим дослідженням для підбору донора при трансплантації органів.

•Деякі алельні варіанти генів HLA II класу асоційовані з підвищеним ризиком захворювань: цукровий діабет I типу, ревматоїдні захворювання, аутоімунний тиреоїдит, сприйнятливість до інфекційних захворювань та ін.

Показання для HLA-типування та генотипування при вагітності.

Кожен з генів може мати тисячі варіантів - алелів. Різноманітні поєднання алелей і забезпечують багатоваріантність комбінацій генів. Саме збіг алелей і говорить про генетичну сумісність чи несумісність двох людей. Дитина отримує по одному гену від матері й від батька.

Невідповідність подружжя за HLA-антигенами і відмінність зародка від материнського організму є важливим моментом, необхідним для збереження і виношування вагітності. Якщо є сумісність подружжя за HLAантигенами II класу, то антитіла до них не виробляються і не захищають плід від материнських природних кілерів. Наявність більш ніж 3 загальних генів HLA у чоловіка і дружини є однією з причин звичних викиднів.

Подібність подружжя за антигенами тканинної сумісності призводить до "схожості" зародка на організм матері, що стає причиною недостатньої антигенної стимуляції імунної системи жінки, і необхідні для зачаття або збереження вагітності реакції не запускаються. Велике число співпадаючих антигенів головного комплексу гісто-сумісності (HLA) у подружжя