16. Методы работы с микроорганизмами

Большинство микроорганизмов имеют очень маленькие размеры – значительно меньше той величины, которая может быть воспринята человеческим глазом (≥ 100 мкм). Разрешающая способность светового микроскопа, т.е. возможность различать две рядом лежащие точки, составляет 0,2 мкм. Это позволяет видеть не только большинство микроорганизмов, но и отдельные структурные компоненты клетки, такие как оболочка, ядро, вакуоли. Однако увидеть вирусы и изучить ультраструктуры клеток микроорганизмов позволяет только электронная микроскопия. Современные электронные микроскопы имеют разрешающую способность около 0,001 мкм. Поэтому микроскопирование, как метод работы широко используется в микробиологической практике.

Микроорганизмы чрезвычайно разнообразны не только по организации клеток, но и по своим биохимическим признакам, однако методы работы с ними довольно однотипны. Многие микроорганизмы независимо от их видовой принадлежности осуществляют одни и те же биохимические процессы превращения определенных соединений. Такие микробы объединяют в одну физиологическую группу.

Количественное определение микроорганизмов в различных объектах (природной, питьевой, сточной воде, почве, активном иле, биопленке) проводят для оценки общей обсемененности и санитарно-эпидемиологической опасности, а также в технологических целях при биологической очистке сточных вод. Для выявления роли микроорганизмов в биохимических процессах, происходящих в природе и на очистных сооружениях водопровода и канализации, выделяют и изучают отдельные систематические и физиологические группы.

Основными методами определения количества микроорганизмов являются: 1) метод прямого счета клеток под микроскопом в препарате, подготовленном из анализируемой пробы воды, почвы и т.д.; 2) метод посева на плотные или жидкие питательные среды.

Различные модификации метода прямого счета позволяют наиболее полно учесть численность микроорганизмов в исследуемом образце. Однако методом прямого счета определяются как живые, так и мертвые клетки микроорганизмов.

Методом посева на питательные среды учитываются только жизнеспособные клетки. Существуют среды, состав которых позволяет выращивать и определять на них многочисленные виды микроорганизмов. Для выделения определенных физиологических групп применяются специальные среды, пригодные для развития микроорганизмов только одной физиологической группы. Сущность метода заключается в посеве строго измеренного объема подготовленной пробы на поверхность плотной питательной среды или в пробирку с жидкой средой, инкубации посева в оптимальных для тех или иных видов микроорганизмов условиях и подсчете количества клеток во взятом объеме пробы.

При использовании твердых сред после посева и инкубации подсчитывают число выросших колоний. Считается, что каждая колония вырастает из одной клетки. Зная объем пробы, взятой для посева, рассчитывают число микроорганизмов в 1 мл или в 1 г исследуемого материала.

Количественный учет микроорганизмов на жидких средах проводится методом предельных разведений. Сущность метода состоит в следующем. Готовят несколько последовательных разведений из исследуемой пробы. Из каждого разведения делают три параллельных посева в пробирки с жидкой средой. По прошествии необходимого срока инкубации в каждой из засеянных пробирок отмечают наличие или отсутствие роста микробов. Расчет ведут по наибольшему разведению, в посевах которого обнаружен рост. Считается, что этот наименьший объем воды содержал только одну способную к размножению и в процессе инкубации размножившуюся особь. Точные подсчеты производят, пользуясь специальными таблицами.