Д6343 Черныш ВГ Изучение морфологии различных видов дрожжей

изолированного помещения – бокса, в котором проводят пересевы чистых культур микроорганизмов в условиях строгой стерильности.

Помещения должны располагаться так, чтобы были обеспечены их защита от влияния внешних факторов (повышенной температуры, влажности, запыленности, шума, вибрации); прохождение чистых и зараженных материалов без пересечения путей. В каждом помещении должны быть холодное и горячее водоснабжение, емкость с раствором для дезинфекции рук.

3.1. Аппаратура и оборудование

Микробиологическая лаборатория должна быть оборудована:

–автоклавами (не менее двух);

–электрическими суховоздушными или водяными термостатами, отрегулированными на разные температурные режимы;

–холодильниками (несколько штук);

–дистилляторами;

–центрифугами;

–рН-метром;

–весами лабораторными, техническими, аналитическими разных классов точности;

–водяной баней с автоматическим терморегулятором для сохранения расплавленных агаровых сред до употребления или культивирования посевов при постоянной температуре;

–стерилизационным сушильным шкафом с автоматическим терморегулятором для стерилизации стеклянной посуды;

–электроплитками, спиртовками;

–рефрактометром;

–микроскопами различных систем.

Для проведения исследований и облегчения выполнения трудоемких операций допускается использование различных приборов и оборудования: дозатора питательных сред и реактивов, механического смесителя, устройств для фильтрования, прибора для подсчета колоний, аппарата для культивирования в модифицированной среде (анаэростат).

Из лабораторной посуды необходимо иметь: стеклянные или пластиковые емкости (пробирки, колбы, флаконы, бутыли); стеклянные

21

или пластиковые чашки Петри (как правило, диаметром 90–100 мм); пипетки пастеровские и градуированные вместимостью 10, 5, 2, 1 см3; воронки, цилиндры, мензурки, капельницы и другую посуду. В лаборатории должно быть достаточное количество предметных и покровных стекол, лабораторных инструментов: ножниц, пинцетов, скальпелей, кювет, игл и петель для посевов и пересевов культур.

На рабочем столе (с покрытием, необходимым для удобства проведения санитарной обработки) находятся: микроскоп, штатив с красителями для приготовления окрашенных мазков, пробирки со стерильной водой, спиртовка для создания асептических условий, микробиологическая петля, фарфоровые стаканы для использованных пипеток и предметных стекол, штатив для пробирок с культурами микроорганизмов.

В рабочем столе находятся: обезжиренные предметные и покровные стекла, небольшие кусочки фильтровальной бумаги для просушивания препаратов, спички для зажигания спиртовки, карандаш по стеклу.

3.2. Бокс

Бокс представляет собой небольшую комнату, разделенную на две части. Основное помещение предназначено для проведения микробиологических работ, вторая часть бокса (предбоксник) необходима для того, чтобы не допустить прямого контакта помещения для пересевов с наружным помещением. Такое устройство исключает резкое перемещение воздуха и, следовательно, занесение извне посторонней микрофлоры. В предбокснике должен находиться комплект чистой рабочей одежды: халат, колпачок или косынка и тапочки, в которых можно находиться только в помещении бокса.

Все поверхности в боксе должны иметь покрытия, допускающие обработку дезинфицирующими составами, стойкие к ультрафиолетовому излучению, применяемому для стерилизации бокса.

На рабочем столе необходимо иметь спиртовку, спички, штатив для пробирок, биологическую петлю и иглу, восковой карандаш по стеклу или маркер, спирт, вату, стакан для использованных в работе пипеток и шпателей. Перед началом работы руки и поверхность стола обязательно протирают 70 %-м раствором этилового спирта.

22

Помещение бокса стерилизуют с помощью бактерицидных ламп, прикрепленных к стенкам бокса на уровне 1,5–2,0 м от пола; одну лампу устанавливают на расстоянии 60–70 см над поверхностью стола.

3.3. Правила работы с микроорганизмами

При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдение ряда правил.

Микроорганизмы в лабораторных условиях выращивают обычно в пробирках, колбах, чашках Петри в жидких и плотных питательных средах.

При пересеве дрожжей с одной среды на другую или при извлечении части клеток для приготовления препарата необходимо строго соблюдать условия, которые позволили бы предохранить культуру от загрязнения другими микроорганизмами.

Для приготовления препаратов микроорганизмов, выращенных на поверхности плотной питательной среды, или для пересевов культуры с одной среды на другую пользуются бактериологической петлей. Стерилизацию петли проводят в пламени горелки, прокаливая докрасна проволоку и обжигая примыкающую к ней часть держателя, вводимую внутрь пробирки. При прокаливании петлю рекомендуется держать в пламени почти вертикально, чтобы проволока была равномерно раскалена на всем протяжении. Лишь после такой стерилизации петлю можно вводить в пробирку с культурой микроорганизма. Прикосновение к культуре слишком горячей петли может повредить клетки. Поэтому петлю следует предварительно остудить, прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток.

Оставшиеся на петле после пересева или приготовления препарата клетки тщательно сжигают в пламени горелки. Прокаливание петли в этом случае начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, чтобы микробная масса, оставшаяся на петле, подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Такой порядок стерилизации петли необходим потому, что при быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызги-

23

вание и образуется аэрозоль, загрязняющий воздух. Только после этого петлю можно поместить в специальный штатив.

Необходимо следить за тем, чтобы дрожжевые препараты не загрязняли руки, стол и окружающие предметы.

Ватные пробки, закрывающие сосуды с микроорганизмами, не должны своей внутренней частью соприкасаться со столом или руками.

Всю рабочую лабораторную посуду, содержащую живые микроорганизмы, после работы необходимо подвергнуть термической обработке в автоклаве.

При работе со спиртовками, особенно в условиях бокса, следует остерегаться воспламенения паров спирта, следить за своевременным заполнением спиртовки, не зажигать ее от другой спиртовки, гасить пламя только специальным колпачком.

В случае воспламенения ватных пробок в пробирках или колбах необходимо укрыть их полотенцем, перекрыв к ним доступ воздуха.

4. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ДРОЖЖЕЙ

Цель работы – получение практических навыков при посеве дрожжей в жидкую и плотную питательные среды, изучение макроморфологических признаков колоний и морфологических признаков клеток дрожжей различных родов и видов.

4.1. Приготовление питательных сред

Для изучения макроморфологических особенностей клеток дрожжи культивируют на поверхности солодового агара, морфологических – в жидком солодовом сусле. Солодовое сусло готовят с содержанием 8–10 % сухих веществ и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин. В охлажденное сусло вносят дрожжи с поверхности скошенного сусла-агара.

При приготовлении сусла-агара к солодовому суслу добавляют 2 % агара, нагревают при перемешивании до кипения, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 112 °С в течение 20 мин.

Стерильную агаровую среду разливают в чашки Петри при соблюдении условий асептики. Чашки оставляют в боксе на двое–трое

24

суток для подсушивания среды. Затем каплю дрожжевой суспензии помещают на поверхность сусла-агара в чашке Петри, равномерно растирая ее стерильным стеклянным шпателем и, не обжигая шпатель в пламени спиртовки, растирают им поверхности второй и третьей чашек Петри. После рассева дрожжи инкубируют при 26–28 °С в течение трех–пяти суток. Как правило, на поверхности питательной среды последней чашки дрожжи растут в виде изолированных колоний.

При другом способе рассева (истощающим мазком) каплю дрожжевой суспензии с помощью микробиологической петли наносят на поверхность плотной питательной среды, содержащейся в чашке Петри, и растирают ее петлей на 1/4 поверхности. Затем, не обжигая петлю в пламени спиртовки, в той же чашке последовательно на остальных частях среды проводят ряд штрихов. На последних штрихах дрожжи вырастают в виде изолированных колоний.

Используемые среды и растворы. Для приготовления солодово-

го сусла в 1 дм3 водопроводной воды, нагретой до 48–50 °С, понемногу засыпают 250 г размолотого солода, помешивая, чтобы не образовывались комки. Температура при этом снижается до 45 °С. Ее следует поддерживать на этом уровне в течение 30 мин в водяной бане. По истечении этого времени взвесь нагревают до 55–58 °С и выдерживают при этой температуре в течение часа. Затем температуру повышают до 63 °С и поддерживают на этом уровне до полного осахаривания крахмала. Полноту осахаривания проверяют с помощью раствора Люголя – до появления желто-коричневой окраски сусла. Свежеприготовленное солодовое сусло нагревают до кипения и кипятят 5–10 мин. Образовавшийся при кипении осадок отделяют фильтрованием. В целях получения совершенно прозрачного сусла его дополнительно осветляют яичным белком. Для этого белки яиц, взбитые с двойным (по объему) количеством воды, вносят в сусло, нагретое до 50 °С, и тщательно перемешивают. При этом белок свертывается и увлекает в осадок оставшиеся в сусле взвешенные частицы. Осадок удаляют фильтрованием сусла через складчатый фильтр. Затем сусло разводят водой до содержания 8–10 % сухих веществ, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют при 112 °С в течение 30 мин.

Раствор Люголя готовят следующим образом: 2 г йодистого калия растворяют в 5 см3 воды и прибавляют 1 г кристаллического йода, затем доводят объем до 300 см3.

25

4.2. Морфологические особенности дрожжей

Для наблюдения дрожжей в световом микроскопе необходимо соответствующим образом приготовить препарат. Как правило, препараты готовят на предметных стеклах. Предметные стекла должны иметь толщину, не превышающую 1,2–1,4 мм. Применение более толстых стекол снижает четкость изображения. Поверхность предметных стекол должна быть хорошо подготовлена. Стекло надо тщательно очистить и обезжирить, чтобы жидкость равномерно растекалась по нему, а не собиралась в выпуклые, медленно высыхающие капли. Наиболее надежный способ обезжиривания – обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием водой и спиртом. Можно также тщательно натереть сухое стекло мылом, после чего вытереть хлопчатобумажной салфеткой. Еще один способ – обжигание поверхности стекла в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла также должны быть вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15–0,17 мм. Кипячение стекол в растворах щелочей не рекомендуется, так как щелочи разъедают стекло, его поверхность становится матовой.

1. Изучение роста дрожжей в жидкой питательной среде.

После инкубации дрожжей в течение семи суток отмечают наличие пленки или островков пленки на поверхности сусла, а также на стенках сосуда; наличие пристеночного кольца, характер осадка (плотный, рыхлый), мути. Характер роста дрожжей зарисовывают.

2. Исследование морфологии клеток различных дрожжей. Го-

товят препараты из каждой представленной культуры: Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis aeria, C.krusei, Rhodotorula rubra, Hansenula anomala, S.diastaticus, Kluyveromyces fragilis. Для этого на поверхность обезжиренного предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю суспензии исследуемой культуры из жидкой питательной среды. Затем осторожно покрывают покровным стеклом каплю так, чтобы между покровным и предметным стеклами не было пузырьков воздуха и жидкость не выступала за края покровного стекла. Дрожжи микроскопируют в препарате «раздавленная» капля. Изучают морфологические особенности каждой культуры: форму и размеры клеток, характер размножения, наличие вакуолей и липидных включений, количество неактивных и мертвых клеток. Зарисовывают клетки.

26

3. Определение количества клеток дрожжей. При определе-

нии числа различных клеток в 1 см3 суспензии используют счетную камеру Горяева–Тома. Для этого камеру покрывают покровным стеклом и притирают его к боковым пластинкам камеры до образования радужных колец Ньютона. Покровное стекло притирают для того, чтобы высота слоя исследуемой жидкости в камере была 0,1 мм. Точность определения количества клеток зависит от того, насколько плотно покровное стекло прилегает к поверхности камеры. Затем каплю исследуемой суспензии после тщательного перемешивания помещают под покровное стекло, после чего счетную камеру помещают на столик микроскопа и находят в поле зрения сетку. Ее легче находить при увеличении в 400 раз (окуляр 10, объектив 40). При этом увеличении в поле зрения микроскопа помещается один большой квадрат, состоящий из 16 маленьких квадратов (рисунок).

Камера Горяева

27

Подсчитывают все клетки, находящиеся внутри большого квадрата, а также на пограничных линиях, если клетки больше чем наполовину находятся в данном квадрате. Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, то их считают только на двух смежных сторонах, например правой и верхней.

В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших квадратах, находящихся по углам и в центре сетки. Если в густых суспензиях клетки считать трудно, их следует разбавить водой и пользоваться такими разведениями, при которых количество клеток в одном большом квадрате будет не более 30. Для получения достоверного результата необходимо сосчитать не менее 600 клеток

Объем одного большого квадрата во всех счетных камерах равен 1/250 мм3, следовательно, объем пяти квадратов равен 5/250 мм3. Чтобы определить количество клеток в 1 см3 (или 1000 мм3) исследуемой суспензии, нужно среднюю сумму количества клеток в пяти больших квадратах умножить на 50 000.

Число клеток дрожжей в 1 см3 суспензии удобно определять по формуле

Х = А∙50 000∙В,

где А – сумма клеток в пяти больших квадратах; В – разведение суспензии дрожжей; 50 000 – коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 см3.

Для подсчета клеток можно использовать другую формулу, позволяющую выражать полученный результат сразу в млн кл/ см3 :

X 20nK ,

где Σn – сумма количества клеток в пяти квадратах сетки; K – разбавление исходной суспензии.

Подсчитывают в суспензии количество клеток (в процентах) с различными морфологическими характеристиками. Записывают полученные результаты.

4. Определение размеров клеток. Размеры клеток измеряют при помощи окулярного микрометра (1 мм состоит из 10 делений). Его помещают в диафрагму окуляра. Для определения истинной величины клеток необходим поправочный коэффициент, который устанавливают

28

с помощью объектного микрометра с делениями 1 мм на 100 частей (одно деление равно 10 мкм). Объектный микрометр помещают на столик микроскопа и определяют, какое количество окулярных и объектных делений помещается на отрезке от окулярного нуля до ближайшего совпадения черточек. В данном случае одно деление окулярного микрометра равно 4 мкм, т. е. 20 : 5.

При микроскопировании препарата дрожжей с тем же объективом и окуляром, при которых определяли поправочный коэффициент, измеряют длину и ширину клеток. Замеряют обычно 50–100 клеток, затем средний показатель умножают на поправочный коэффициент. При определении размеров клеток определяют их минимальные, средние и максимальные размеры.

Для облегчения работы можно пользоваться не объектным, а окулярным микрометром, определяя цену деления его шкалы при использовании различных окуляров и объективов (таблица).

5. Изучение морфологии колоний дрожжей. Для этого следует описать колонии дрожжей, выросших на поверхности плотной питательной среды в чашках Петри. При описании колоний отмечают: их вид; размер (мелкие, крупные); форму (круглые, неправильные); пигментацию (белые, беж, серые, розовые, красные); характер поверхности (гладкая, складчатая, морщинистая, блестящая, матовая); профиль (плоские, выпуклые); узор (однородные, пятнистые, радиально исчерченные). Морфологию колоний дрожжей изучают при помощи лупы. При просмотре колоний в световом микроскопе (с увеличением окуляра 10, объектива 10, бинокулярной насадки 2,5) следует определить и зарисовать наличие мицелия или псевдомицелия.

29