Основы генной
инженерии
Лекция 3
Анализ геномов и экспрессии генов на уровне транскрипции
На предыдущих лекциях мы научились
Выделять нуклеиновые кислоты и
клонировать их с помощью векторов
Сегодня научимся
Получать физические карты генов,
хромосом и больших геномовИсследовать экспрессию генов на
уровне транскрипции
Библиотека (клонотека) фрагментов ДНК
Набор клонированных фрагментов ДНК в составе бактериальных клеток или фаговых частиц, представляющих весь геном или его определенную часть
Геномные библиотекиХромосомные библиотекиБиблиотеки кДНК
Репрезентативность
библиотеки
Вероятность, с которой в ней представлена любая последовательность генома или его исследуемой части
Размер библиотеки, в которой любая часть генома представлена с вероятностью 99%
Вектор |
Разме |
Размер |
|
|
р |
библиотеки (×103 |
|
|
вставк |
клонов) |
|
|
и |
Бактери |
Животн |
|
(т.п.н.) |
и |
ые |
Плазмиды |
4 |
|
4,6 |
3500 |
Фаг λ |
18 |
|
1,0 |
770 |
Кос иды |
40 |
|
0,458 |
350 |
Размеры генома: |
|
|
46 |
|
BAC |
300 |
6 |
|
|
Бактерии – ~4 × 10 |
п.н0,059.животные – |
|||
~3 × 109 п.н.
Этапы создания библиотеки ДНК
1.Выбор и подготовка вектора
2.Подготовка геномной ДНК или кДНК
3.Лигирование фрагментов ДНК с вектором
4.Введение рекомбинантных ДНК в клетки
5.Консервация библиотеки
Упорядоченные библиотеки: матрицы случайных клонов
Неупорядоченные |
Упорядочен |
библиотеки |
ная |
|
библиотека |
После рассева на чашки Петри индивидуальные колонии бактерий выращивают в виде матрицы на твердой питательной среде или в 96-луночных
планшетах
Полное и частичное (неполное) расщепление ДНК рестриктазами
Complete digestion
построенные из неперекрывающихся и перекрывающихся фрагментов ДНК
Упорядоченные библиотеки:
перекрывающиеся фрагменты ДНК
Случайные фрагменты ДНК библиотеки объединяют в контиги