Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Генная инженерия / Лекция 1 Геом, ген, клонирование генов.pptx
Скачиваний:
24
Добавлен:
10.09.2020
Размер:
7.55 Mб
Скачать

Нобелевская премия

по физиологии и медицине 1978 г.

Вернер Арбер

Даниэл

Хамилтон Смит

Система

Натанс

Очистка и

рестрикции и

Электрофорез

использование

модификации у

фрагментов

рестриктаз

бактерий

ДНК, первые

класса II

"for the discovery of restrictionфизическиеenzymes and their application to problems of

molecular genetics"

карты вируса

Нобелевская премия

по физиологии и медицине 1980 г.

Пол Берг

Уолтер

Фредерик Сэнгер

Рекомбинантные

Гилберт

1.

Структура

ДНК, векторы на

Секвенирование

2.

инсулина

основе хромосом

ДНК – метод

Метод

вирусов

 

 

секвенирования

Максама-

 

"for their contributions concerning the determination of base

Гилберта

ДНК

sequences in nucleic acids"

 

Выделение нуклеиновых кислот

Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК

Фенольный метод выделения ДНК

Нейтраль

ные

значения pH

Водная

фаза (ДНК и

Денатурирова РНК)нные белки

Фенольная

фаза

Кислые

значения pH

Водная

фаза

(РНК)

Фенольная фаза (ДНК)

Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла

Сорбция: кислые pH, высокая ионная сила

Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила

Гуанидинизотиоц

ианат

Щелочной метод выделения бактериальных плазмид

pH 8,0

pH 12,0

pH 8,0

Фрагменты

Кольца

Линейная

линейной

плазмидной

ДНК

ДНК и

ДНК остаются

агрегирует,

кольцевая

зацепленными

кольцевая

плазмидная

друг за друга

восстанавлив

ДНК

 

ается

Формы

плазмидной ДНК

Суперскрученная

Одно- цепочечный разрыв ДНК

EcoRI

ЛинейнаяКольцевая ковалентно-

Релаксированная

замкнутая

 

Электрофоретическая подвижность

 

разных форм плазмиды в присутствии

 

 

бромистого этидия

 

 

Увеличение отношения EtBr/Д

 

Предел

-

 

визуальной

 

 

чувствительнос

 

Релакс

ти –

-

50 нг

 

Линейная

 

 

ДНК/полоса

 

0

Супер.

+

Бромистый этидий

+

 

Сортировка микрочастиц в четырехпараметрическом проточном цитометре

б

Буферный

Создание электрического

 

"Зеленый" сигнал

 

раствор

заряда на каплях

ФЭУ

 

 

 

 

 

 

 

 

Суспензия

Зеленый

Оранжевый

 

 

хромосом

 

фильтр

 

 

 

фильтр

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ФЭУ

"Оранжевый"

 

 

 

 

 

сигнал

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ФЭУ

Сигнал "Бокового

 

 

 

 

светорассеяния"

 

 

 

 

 

 

Проточная

 

 

Голубой

 

 

 

кювета

 

 

 

 

 

 

 

 

фильтр

 

 

 

 

 

PD

Сигнал "Прямого

 

 

Лазер

 

светорассеяния"

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Отклоняющие

 

Голубой

 

 

 

 

 

фильтр

 

 

 

 

пластины

 

 

 

 

 

ЭВМ

Пример разделения метафазных хромосом человека с помощью двухлазерного проточного цитометра

г

Область

 

сортировки

 

 

Интенсивность флуоресценции (Хёхст 33258)

Интенсивность флуоресценции (Хромомицин А3)

FACS (fluorescence- activated cell (chromosome) sorting

до 105 частиц/мл

суспензиирассеянный свет: форма,

размер и состав (по преломлению света) т.е. метаболическое состояние клетокчисло фотодетекторов

определяет кол-во измеряемых параметров (обычно 5-6)

Хёхст 33258 – AT-пары

хромомицин A3 – GC-парыразделение

гомологичных хромосом

19 и 21 родителей