
- •Основы
- •«Новые направления в науке гораздо чаще создаются с помощью новых методов, а не
- •Что такое «генная инженерия»?
- •В классической генетике и
- •Клонированная самка муфлона,
- •Влияние генной инженерии на современную биологию
- •Биотехнология
- •Промышленная
- •Сельскохозяйственная (зеленая) биотехнология Green gene technology (GGT)
- •Мочить генных инженеров!
- •Фармацевтическая (красная) биотехнология – Red Biotech
- •Влияние генной инженерии на современную медицину
- •Влияние генной инженерии на современную медицину
- •Системные подходы в молекулярной биологии и генетике
- •Центральная догма молекулярной биологии
- •Определение терминов: «Геном»
- •Концепция бактериального пангенома (pan-genome)
- •Парадокс C (C-value paradox)
- •Южноамериканская двоякодышащая рыба
- •Растения с экстремальными размерами генома
- •Животные–лидеры по
- •Парадокс исчезает, загадка остается
- •Последовательности нуклеотидов генома человека
- •Количество генов у организмов разных таксономических групп
- •Резюме по геному
- •Определение терминов: «Ген»
- •Один ген – один фермент
- •Концепция гена 1960-х годов
- •Основные атрибуты гена остались незыблемыми
- •Хорошо забытое старое
- •Нобелевская премия
- •Нобелевская премия
- •Выделение нуклеиновых кислот
- •Фенольный метод выделения ДНК
- •Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла
- •Щелочной метод выделения бактериальных плазмид
- •Формы
- •Электрофоретическая подвижность
- •Сортировка микрочастиц в четырехпараметрическом проточном цитометре
- •Пример разделения метафазных хромосом человека с помощью двухлазерного проточного цитометра
- •Первые два класса систем рестрикции-модификации
- •Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии
- •Номенклатура рестриктаз класса II
- •Субстратная специфичность рестриктаз класса II
- •Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II
- •Два способа «затупления» липких концов ДНК
- •Механизм
- •Линкер
- •Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК без использования рестриктаз
- •Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназа
- •ДНК-зависимые ДНК- полимеразы
- •Коррекция неправильно включенного нуклеотида 3’→5’-экзонуклеазой ДНК- полимеразы
- •Обратные транскриптазы (ОТ)
- •Три стратегии синтеза кДНК обратной транскриптазой
- •Синтез
- •Терминальная трансфераза в синтезе гомополимеров и клонировании
- •Векторы
- •Емкости векторов разных классов
- •Свойства, которыми должен обладать любой вектор
- •Плазмидный вектор pUC18
- •Предотвращение образования плазмидного вектора без вставки с помощью щелочной фосфатазы

Нобелевская премия
по физиологии и медицине 1978 г.
Вернер Арбер |
Даниэл |
Хамилтон Смит |
Система |
Натанс |
Очистка и |
рестрикции и |
Электрофорез |
использование |
модификации у |
фрагментов |
рестриктаз |
бактерий |
ДНК, первые |
класса II |
"for the discovery of restrictionфизическиеenzymes and their application to problems of |
|
molecular genetics" |
карты вируса |

Нобелевская премия
по физиологии и медицине 1980 г.
Пол Берг |
Уолтер |
Фредерик Сэнгер |
|
Рекомбинантные |
Гилберт |
1. |
Структура |
ДНК, векторы на |
Секвенирование |
2. |
инсулина |
основе хромосом |
ДНК – метод |
Метод |
|
вирусов |
|
|
секвенирования |
Максама- |
|
"for their contributions concerning the determination of base |
|
Гилберта |
ДНК |
sequences in nucleic acids" |
|
Выделение нуклеиновых кислот
Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК

Фенольный метод выделения ДНК
Нейтраль
ные
значения pH
Водная
фаза (ДНК и
Денатурирова РНК)нные белки
Фенольная
фаза
Кислые
значения pH
Водная
фаза
(РНК)
Фенольная фаза (ДНК)

Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла
Сорбция: кислые pH, высокая ионная сила
Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила
Гуанидинизотиоц
ианат

Щелочной метод выделения бактериальных плазмид
pH 8,0 |
pH 12,0 |
pH 8,0 |
Фрагменты |
Кольца |
Линейная |
линейной |
плазмидной |
ДНК |
ДНК и |
ДНК остаются |
агрегирует, |
кольцевая |
зацепленными |
кольцевая |
плазмидная |
друг за друга |
восстанавлив |
ДНК |
|
ается |

Формы
плазмидной ДНК
Суперскрученная
Одно- цепочечный разрыв ДНК
EcoRI
ЛинейнаяКольцевая ковалентно- |
Релаксированная |
замкнутая |
|

Электрофоретическая подвижность |
|
|
разных форм плазмиды в присутствии |
|
|
|
бромистого этидия |
|
|
Увеличение отношения EtBr/Д |
|
|
Предел |
- |
|
визуальной |
|
|
чувствительнос |
|
Релакс |
ти – |
- |
50 нг |
||
|
Линейная |
|
|
ДНК/полоса |
|
0
Супер.
+
Бромистый этидий |
+ |
|

Сортировка микрочастиц в четырехпараметрическом проточном цитометре
б |
Буферный |
Создание электрического |
|
"Зеленый" сигнал |
||
|
раствор |
заряда на каплях |
ФЭУ |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
Суспензия |
Зеленый |
Оранжевый |
|
||
|
хромосом |
|
фильтр |
|
||
|
|
фильтр |
|
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
ФЭУ |
"Оранжевый" |
|
|
|
|
|
сигнал |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ФЭУ |
Сигнал "Бокового |
|
|
|
|
|
светорассеяния" |
||
|
|
|
|
|
||
|
Проточная |
|
|
Голубой |
|
|
|
кювета |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
фильтр |
|
|
|
|
|
PD |
Сигнал "Прямого |
|
|
|
Лазер |
|
светорассеяния" |
|
||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
Отклоняющие |
|
Голубой |
|
|
|
|
|
фильтр |
|
|
|
|
|
пластины |
|
|
|
|
|
ЭВМ

Пример разделения метафазных хромосом человека с помощью двухлазерного проточного цитометра
г |
Область |
|
сортировки |
|
|
Интенсивность флуоресценции (Хёхст 33258)
Интенсивность флуоресценции (Хромомицин А3)
FACS (fluorescence- activated cell (chromosome) sorting
до 105 частиц/мл
суспензиирассеянный свет: форма,
размер и состав (по преломлению света) т.е. метаболическое состояние клетокчисло фотодетекторов
определяет кол-во измеряемых параметров (обычно 5-6)
Хёхст 33258 – AT-пары
хромомицин A3 – GC-парыразделение
гомологичных хромосом
19 и 21 родителей