Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения
2.
Секвенирован ие синтезом (sequencing by synthesis – SBS)
•Включение
флуоресцентного
терминатора
•Считывание
•Деблокирование
и удаление флуорофора
Структура
некоторых
обратимых
терминаторов синтеза ДНК
|
Включаются в ДНК |
|
3’-O- |
||
только мутантными |
||
Аллил |
ДНК-полимеразами |
Обратимая блокировка 3’-ОН |
3’-O-Азидометил |
группы |
|
Извлечение информации из неупорядоченных микроматриц при секвенировании ДНК
|
C |
|
A |
T |
C |
G |
|
|
|
T |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Каждый |
Цикл |
1 |
2 |
3 |
4 |
dNTP |
|
мечен |
||||||
ы: |
|
5 |
|
6 |
|
своим |
|
|
|
|
|
|
флуорофо |
|
|
|
|
|
|
Все dNTPs |
|
|
|
|
|
|
ром |
|
|
|
|
|
|
мечены |
|
|
|
|
|
|
одним |
Цикл |
1 |
|
2 |
3 |
флуорофо |
|
|
ром |
|||||
ы: |
|
|
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
В каждом |
|
|
|
|
|
|
цикле |
Цикл |
5 |
|
6 |
7 |
добавляют |
|
ы: |
|
|
8 |
|
|
только |
|
Последовательности, верхний ряд: CTAGTG, нижний |
|||||
ряд: CAGCTA |
один dNTP |
|
Проточная ячейка Полонатора и схема получения изображений
Снимок
436
Снимок
217
Снимки
320х320мкм
Снимок
1
Снимок
0Снимок
217
Снимо
к
2179
Слив
Канал
0
Снимо
к
1962
Вход
реагент
ов
Покровн
ое
стекло
Канал
7
Выход
реагент
ов
Секвенирование лигированием (1)
Секвенирование
лигированием
(2)
Секвенатор третьего поколения фирмы Pacific Biosciences
Производные нуклеотидов для измерения флуоресценции в реальном времени
Включение нуклеотида в ДНК сопровождается
освобождением
флуорофора
Строение и принцип действия SMRT-чипа
(Single Molecule Real Time Sequencing-chip)
SMRT-чип 43,5 х 32,8 мкм
ZMW- волновод
Металл |
Источник |
100 нм |
|
|
света |
|
Диаметр отверстия каждого |
|
волновода (50 нм) в SMRT-чипе |
Подложка из |
значительно меньше длины волны |
стекла |
видимого света, поэтому свет |
|
проникает вглубь лишь на |
Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе
Меченые dNTPs
Одна молекула ДНК- полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода
Включившийся dNTP
Эмисси Возбуждея ние