Основы генной инженерии и биотехнологии
Лекция 5
Генная инженерия в исследовании белков
Задачи белковой инженерии
Создание белков с новыми свойствами на основе новых аминокислотных последовательностей, а также путем модификации остатков аминокислот в природных полипептидных цепях
Свойства ферментов, важные для биотехнологии
Реакции происходят в мягких
условиях (температура, pH)
Высокая эффективность (kкат/kнекат)
до 1017
Высокая специфичность.
Кажущаяся константа (kкат/kМ) до 108
Недостаток: осуществляют
реакции, происходящие только в
Две стратегии современной белковой инженерии
Рациональный дизайн белков
Конструирование белков de novo
Конструирование полипептидов с элементами известной вторичной структуры: α-спирали, β-слои, различные функциональные домены (цинковые пальцы, спираль-поворот-спираль, центры связывания ионов металлов)
Рациональный редизайн белков
Гибридные белки и ферменты. Изменение субстратной специфичности ферментов. Повышение
стабильности белков – поперечные сшивки
Направленная эволюция белковых молекул
Отбор белков с нужными
При рациональном редизайне необходимо изменять конкретные аминокислотные остатки в белке:
1.Направленным мутагенезом и/или
2.С помощью химических модификаций боковых цепей
Направленный мутагенез с использованием ПЦР и перекрывающих ся праймеров (Overlap extension PCR)
Введение точковых мутаций
Направленный мутагенез с использованием ПЦР и перекрывающихся праймеров
Получение вставок и делеций
Направленный мутагенез по методу Кункеля
E.coli ung, dut
секвеназа |
урацил- |
|
ДНК- |
||
|
||
|
гликозил |
|
|
аза |
|
ung – ген урацил-ДНК-гликозилазы, dut - ген dУТФазы |
||
1 |
Введение нескольких |
2 |
мутаций с |
использованием ПЦР и |
метил-чувствительной рестриктазы DpnI
ПЦР с мутагенизирующими праймерами 1 и 2,
затем 3 и 4 dam-ДНК-метилаза –
полное метилирование dsДНК (N6 в A)
|
Рестриктаза DpnI – |
3 |
расщепляет полностью |
метилированные сайты |
4