Голодок Л.П. та ін. Лабораторні роботи із курсу вірусологія

30

метод дозволяє зробити точний підрахунок інфекційно-активних одиниць бактеріофага за утворенням негативних колоній на газоні чутливої культурихазяїна в результаті лізису бактеріальних клітин після розмноження вірусів всередині них. Метод полягає у використанні нижнього щільного шару агару (1,5%) для живлення бактерій, а верхнього м’якого шару агару (0,7%) – для розвитку інфекційної системи «фаг – бактерія». Полегшена дифузія фагових часток завдяки зниженій концентрації агару забезпечує циклічність інфекційного процесу, коли кожна генерація фагового потомства після лізису клітини-хазяїна здатна інфікувати сусідні клітини. У результаті цього від одного віріона утворюється одна прозора зона відсутності росту бактерій – стерильна бляшка. Для достовірності визначення титру фага проводять серію повторюваних дослідів (2 – 3) із ряду розведень вихідного фаголізату, а результати підрахунку кількості негативних колоній кожного експерименту усереднюють з урахуванням розведення і об’єму внесеного матеріалу.

Хід роботи

1.Для експерименту використовують фаголізат, збережений після роботи з отримання чистої лінії фага.

2.Живильні середовища готують напередодні постановки досліду. У чашки Петрі розливають 1,5%-й МПА в кількості 25 – 30 мл. Щоб запобігти контамінації мікрофлорою повітря, до розплавленого живильного агару перед розливанням додають 0,004%-й спиртовий розчин генціанового фіолетового з розрахунку 0,1 мл барвника на кожні 100 мл МПА. Чашки із середовищем накривають стерильним фільтрувальним папером і підсушують 30 хв у термостаті або 2 – 3 год за кімнатної температури, після чого закривають кришкою і залишають на ніч за кімнатної температури. Підготовлене середовище повинно бути абсолютно сухим, тому що навіть незначе зволоження може змінити кількісні показники вмісту фагових частинок у досліджуваній рідині.

3.Напіврідкий 0,7%-й МПА, розлитий у пробірки по 2,5 мл і простерилізований у них, може бути приготований за декілька днів до постановки досліду. Перед використанням цей агар витримують на водяній бані за температури +45ºС.

4.У день постановки досліду з рідини, що містить титрований фаг, готують у

пробірках ряд послідовних розведень у МПБ з 0,4% глюкози і 0,02% CaCl2 (так само, як під час титрування фага на рідких середовищах за методом Апельмана). Для розведень фага також можна користуватися стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду (0,5%-й NaCl). Потім у пробірки з 0,7%-м МПА, розплавленим у водяній бані і охолодженим до температури 44 – 46°С, доливають по 0,1 мл розведень титрованого фага.

5.У кожну пробірку вносять по 0,1 мл гомологічної до фага культури. До кожної пробірки з адсорбційною сумішшю додають по 5 мл м’якого розплавленого і охолодженого до 45ºС агару, ретельно перемішують вміст пробірки, перекочуючи її між долонями, і виливають на чашки Петрі із шаром агару, рівномірно розподіляючи суміш по його поверхні. Після охолодження

31

середовища чашки з посівом інкубують за 29°С протягом 18 – 20 год.

У разі титрування методом агарових шарів слід засівати не менше двох чашок фагом одного й того ж розведення.

6.Титр фага визначають шляхом підрахунку кількості негативних колоній на паралельних чашках і множення середнього значення на показник розведення.

Наприклад, якщо на чашці утворилось 150 БУО за умов внесення 0,1мл фагової суспензії із розведення 10-7, то титр фаголізату буде дорівнювати 150·10·107 = 1,5·1010 фагових часток у 1мл. Для статистичної достовірності кожен дослід проводять тричі, а результати підрахунку усереднюють.

7.Розраховують титр фага і вносять його у висновки. Зарисовують чашки із негативними колоніями.

Контрольні питання

1.Принципи титрування фагів.

2.Титрування фагів у рідкому живильному середовищі: метод Апельмана.

3.Титрування фагів на твердому живильному середовищі: метод Граціа.

4.Принципи стерильної роботи в ході досліджень.

Лабораторна робота 8

Фаготипування бактерій

Мета: навчитися типувати мікроорганізми за допомогою фагових тестнаборів.

Матеріали та обладнання: чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, МПА, термостат, дослідна культура, діагностичний фаговий набір.

Теоретичні відомості

Фаготипування дозволяє здійснювати внутрішньовидову диференціацію бактерій. Оскільки фаготипна характеристика бактеріальних штамів достатньо стабільна, фаготипування має виняткову значущість для проведення епідеміологічного аналізу. За допомогою фагового маркування можна встановити зв’язки між окремими випадками захворювання і джерелами інфекції, а також шляхами її поширення.

Нині розроблено різні схеми фагодіагностики і фаготипування для багатьох видів бактерій – збудників інфекційних захворювань людини. Найбільш поширене є фаготипування стафілококів. Для типування коагулазопозитивних стафілококів, виділених від людини, застосовують міжнародний набір – Англія, а виділених від великої рогатої худоби – набір Давідсона. Ці набори містять по 23 і 7 типів бактеріофагів відповідно. Типування здійснюють всіма фагами набору одночасно. Типують лише коагулазопозитивні стафілококи, для коагулазонегативних характерна нестабільність даної ознаки. Більшість коагулазонегативних стафілококів не взаємодіють із фагами діагностичних наборів для фаготипування.

Фаготипування також проводять для багатьох інших бактерій. У клінічних

32

дослідженнях його застосовують для вивчення ентеробактерій, у першу чергу сальмонел, шигел, кишкових паличок.

Хід роботи

1.Ліофілізований вміст кожної ампули з типовим фагом розчиняють у 1 мл

МПБ з 0,4% глюкози і 0,02% хлористого кальцію, отримуючи основне розведення 10-1. Далі готують розведення, відповідні одиниці тест-розведення (ТР) і 100 ТР.

2.Добову агарову культуру випробуваного штаму засівають у пробірку з МПБ і вирощують за оптимальної для росту культури температури до появи помітної каламуті (3 – 6 год). У чашки Петрі розливають 1,2%-й МПА з 0,4% глюкози і 0,02% хлористого кальцію (останній додають безпосередньо до готового розплавленого середовища перед розливом по чашках). Чашки із застиглим агаром підсушують 40 – 60 хв за 37°С.

3.За допомогою пастерівської піпетки бульйонною культурою зрошують поверхню агару. Надлишок культури видаляють і підсушують 30 – 40 хв за температури 37°С. Дно засіяної чашки розкреслюють відповідно до кількості використовуваних фагів.

4.У кожен маркований номером фага квадрат засіяного середовища вносять краплю відповідного фага тонко відтягнутою пастерівською піпеткою. Після підсихання крапель фагів чашку перевертають і інкубують 18 – 20 год за 30°С або 5 – 6 год за 37°С і залишають на 18 – 20 год за кімнатної температури.

5.Облік і реєстрацію результатів проводять за ступенем лізису культури, застосовуючи систему «плюсів»: ++++ – зливний (повний) лізис; +++ – напівзливний (незначне зростання культури в зоні лізису); ++ – наявність у місці нанесення краплі фага понад 50 колоній плям лізису; + – від 20 до 50 колоній фага; ± – менше 20 колоній фага; - – повна відсутність лізису. Перші три ступені лізису (++++, +++, ++) називають сильною реакцією. Останні ступені лізису (+, ±) – слабка реакція.

Штам вважають типованим, якщо хоча б один фаг дав сильну реакцію. Якщо під час типування 1 ТР отримані лише слабкі реакції або лізис відсутній, то цей штам досліджують повторно з тими ж фагами в розведенні 100 ТР.

Одержані результати описують, у висновках указують фаготип досліджуваного штаму. Зарисовують чашку з фагограмою.

Лабораторна робота 9

Визначення колі-фагів у воді

Мета: визначити титр колі-фагів у зразках води.

Матеріали та обладнання: чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, МПА, термостат, фільтри, проби води, препарат колі-фага, контрольна культура

Escherichia coli.

33

Теоретичні відомості

У санітарній мікробіології та вірусології виявлення колі-фагів у воді – це один з показників, що характеризують якість очищення питної води та охорони ґрунтових вод. У разі виявлення у воді колі-фагів роблять висновок про її забруднення. Крім того, у випадку наявності цих фагів воду обов’язково треба дослідити на патогенні для людини і тварин віруси кишкової групи.

Хід роботи

1.Посівну тест-культуру кишкової палички готують щоразу перед проведенням аналізу. Культуру засівають у пробірку з 5 мл МПБ і інкубують

протягом 5 – 6 год за 37ºС. Концентрація бактеріальних клітин повинна бути не менша 108 клітин/мл.

2.Попередньо в 4 стерильні чашки Петрі розливають по 15 – 20 мл 2%-го МПА, який добу висушують у термостаті. Також готують 4 стерильні пробірки з 5 мл 1%-го МПА. У пробірки з МПА додають по 5 мл проби води та по 1 мл суспензії клітин тест-культури. Обережно перемішують вміст пробірок, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, і виливають на поверхню 2%-го МПА. Вилитий матеріал рівномірно розподіляють і залишають до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушують чашки, витримуючи їх з частково відкритими кришками, після чого закривають та інкубують у положенні догори дном (не можна складати більше ніж 6 чашок у стовпчик) за 37ºС протягом 6 – 8 год. Далі чашки виймають із термостата й залишають у темному місці за кімнатної температури на 18 – 20 год. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів іншої, наявної в матеріалі мікрофлори.

3.Постановка негативного контролю потрібна для підтвердження відсутності контамінації фагом живильних середовищ, лабораторного посуду, устаткування на етапах підготовки та проведення аналізу, а також дозволяє підтвердити здатність тест-культури утворювати рівномірний повноцінний газон. Негативним контролем є стерильна водопровідна вода, яку вивчають у такий же спосіб, як і досліджувані проби води. У випадку виявлення зон лізису на чашках з негативним контролем результати дослідження даної серії проб вважають недійсними. У такому разі необхідно перевірити стерильність живильних середовищ, лабораторного посуду, устаткування та робочу культуру. Негативний контроль єдиний для всіх досліджуваних проб і його здійснюють 1 раз на день.

4.Постановка позитивного контролю передбачає перевірку чутливості тесткультури до фагів. Чутливість перевіряють кожного разу, коли беруть нову пробірку з робочою тест-культурою. Культуру вважають чутливою та придатною для проведення аналізу за наявності чітких зон лізису на повноцінному бактеріальному газоні. За відсутності зон лізису культура не може бути застосована в аналізі і підлягає заміні.

5.Облік результатів. За наявності зон лізису підраховують їх кількість на чотирьох чашках і множать на 10, що у підсумку дає вміст коліфагів у 1 л води досліджуваного зразка. Розраховують титр колі-фага і виносять його у висновки.

34

У нормі титр колі-фага не повинен перевищувати 10 одиниць.

Контрольні питання

1.Реакція наростання титру фага.

2.Фаготипування бактерій та його застосування у клінічній практиці.

3.Метод титрування колі-фагів.

35

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

[Текст] / Л.Б. Борисов. – М.: Мед. информ. агенство, 2001. – 736 с.

Букринская, А.Г. Вирусология [Текст] / А.Г. Букринская. – М.: Медицина,

1986. – 336 с.

Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях [Текст] / под ред. М.И. Соколова [и др.]. – Л.: Спец. лит., 1972. – 198 с.

Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология [Текст] / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. – СПб.: Спец. лит., 1998. – 580 с.

Пилянкевич, А.Н. Электронные микроскопы [Текст] / А.Н. Пилянкевич. – К.:

Наук. думка, 1976. – 205 с.

Поліщук, В.П. Посібник з практичних занять з курсу «Загальна вірусологія» [Текст] / В.П. Поліщук, І.Г. Будзанівська, Т.П. Шевченко. – К.: Фітоцентр, 2005. – 204 с.

Посібник з медичної вірусології [Текст] / за ред. В.М. Гиріна. – К.: Вища шк.,

1995. – 367 с.

Современная микробиология: прокариоты [Текст]: в 2 т. / под ред.

И. Ленгелера [и др.]. – М.: Мир, 2005. – Т. 2. – 496 с.

Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования [Текст] / под ред. А. Г. Букринской. – М.: Наука, 1982. – 455 с.

Bacteriophages: biology and applications [Text] / edited by E. Kutter, A. Sulakvelidze. – Boca Raton: CRC PRESS, 2005. – 528 р.

Cann, A.J. Principles of molecular virology [Text] / A.J. Cann. – Burlington: Elsevier Academic Press, 2005. – 316 с.

Carter, J. Virology: principles and applications [Text] / J. Carter, V. Saunders. – Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 2007. – 382 р.