Голодок Л.П. та ін. Лабораторні роботи із курсу вірусологія

20

Контрольні питання

1. Назвіть мету використання курячих ембріонів в вірусологічних дослідженнях, їх переваги та недоліки, як об‘єкта для культивування вірусів. Принцип ідентифікації вірусів на курячих ембріонах

2. Опишіть особливості анатомії та фізіології курячого ембріону.

3. Як зробити відбір та підготувати курячі ембріони до інфікування? 4. Які умови впливають на репродукцію вірусів в курячих ембріонах? 5. Назвіть методи інфікування курячих ембріонів.

6. Методика отримання вірусовміщуючого матеріалу з органів та тканин інфікованих курячих ембріонів.

7. Типи патологічних змін в органах та тканинах курячих ембріонів.

8. Які умови постановки реакції гемаглютинації? Основні компоненти реакції. Як виявляють титр вірусу у реакції гемаглютинації?

9. Механізм постанови та діагностичне застосування реакції гальмування гемаглютинації.

10. Суть реакції кільцепреципітації. Способи постановки реакції преципітації.

Лабораторна робота 5

Культивування клітин організмів в штучних умовах

Мета: ознайомлення з методами отримання, культивування, морфології та класифікації культур клітин.

Матеріали та обладнання: жива культура клітин, колекція демонстраційних матеріалів – фіксовані покрашені препарати культур клітин тварин та рослин, лабораторний посуд, інструменти (ножиці, пінцети), дезінфікуючи розчини, центрифуга, термостат, мікроскопи, розчин трипсину або вересу, фізіологічний розчин, поживне середовище, сироватка крові крупної рогатої худоби, колекція демонстративних поживних середовищ (сироватка крові, сольові розчини Хенкса, Ерла, Тіроде, штучні поживні середовища 199 та інші), колекція ілюстративного матеріалу.

Теоретичні відомості

І. Типи клітинних культур

Первинні культури клітин. Первинні культури клітин одержують із тканин людини або тварини шляхом їх ферментативної дезінтеграції з використанням холодного або теплого трипсину.

Метод з використанням теплого трипсину полягає в тому, що шматочки тканини або цілі органи ембріона вміщують у 0,25 % розчин трипсину при температурі 37 °С. Під час піпетування у теплому трипсині або перемішування шматочків тканин у трипсині на магнітній мішалці відбувається їх дезагрегація на окремі клітини. Порції клітин збирають у міру їх виділення, центрифугують, трипсин зливають, вносять середовище росту і суспендують у ньому клітини. Принцип методу використання холодного трипсину полягає в тому, що шматочки тканин заливають 0,25 % розчином трипсину і залишають на ніч при температурі 4 °С. Потім розчин трипсину із шматочками тканин підігрівають до 37 °С,

21

витримують кілька хвилин і швидко піпетують; суспензію центрифугують, трипсин зливають, клітини повільно піпетують у середовищі росту і визначають їх кількість у лічильній камері Горяєва.

Перещеплювальні культури клітин. Перещеплювальні клітини – це клітини одного типу, що набули здатність до необмеженого росту. Перещеплювальні клітини, як правило, походять з пухлин або нормальних тканин людини або тварин, які мають змінений каріотип.

Перещеплювані культури клітин вирощують у вигляді суспензій (із стаціонарною або проточною системою подавання живильного середовища) або одношарових культур на поверхні скла в посудинах, матрацах, пробірках, панелях. В останньому випадку необхідне систематичне проведення пасажів (посіви) клітин, використовуючи для цього культури попереднього пасажу або музейні клітини, що зберігаються в умовах консервації. Повноцінну популяцію клітин можна одержати лише за умови використання життєздатних клітин.

Відібрану для пересівання культуру клітин відокремлюють від скла за допомогою трипсину (0,25 %), версену (0,2 %), хімопсину (0,02 %) або механічно, зішкрібаючи та подрібнюючи одержані клітини за допомогою багаторазового піпетування. У разі використання версену відокремлення клітин від скла і формування суспензії відбувається при кімнатній температурі за 5 – 10 хв (порізному для різних культур). Якщо розпушення шару клітин достатнє і почалося відокремлення його від скла, розчин версену зливають, а в матраци заливають мірну кількість середовища росту. Ним старанно змивають клітини із скла посудини. Одержану суспензію клітин після підрахунку в лічильній камері Горяєва розводять середовищем росту до концентрації, необхідної для посіву. Наприклад, у флакони місткістю 100 мл розливають по 20 мл зависі, що містить 40–60 тис. клітин в 1 мл, Формування моношару клітин відбувається за 48 год.

Культури диплоїдних клітин. Диплоїдні клітини – це клітини одного типу, здатні витримувати in vitro близько 100 поділів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів, одержані з ембріона людини, використовують у діагностиці вірусних інфекцій та у виробництві вакцин. Ці культури надзвичайно вибагливі до умов культивування, тому їх рідко застосовують у практиці вірусологічних лабораторій.

Перед початком роботи культуру мікроскопують (рис. 2).

Додатково культури поділяють на патологічні, умовно-нормальні та іморталізовані.

Патологічні культури – це культури, які отримані на основі пухлинних клітин з різною тканинною належністю.

Умовно-нормальні культури – це культури, що отримують на основі методу первинної трипсинізації нормальних тканин.

Іморталізовані культури – це культури, отримані на основі злиття клітин з нормальних тканин та пухлинних клітин.

Відповідно до потреб експериментальної роботи обирають відповідну клітинну лінію, культуру якої можна отримати у Національному банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології. онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького (м. Київ).

22

Рис. 2 Клітинні культури під мікроскопом (інвертна мікроскопія. збільшення

×900)

Слід пам’ятати, що робота із культурами клітин вимагає особливих умов стерильності та складного і коштовного обладнання. При недотриманні умов культивування культури швидко гинуть.

ІІ. Методи виявлення та ідентифікації вірусів в культурі клітин

Зараження культур клітин. Найчастіше для зараження використовують моношарові культури. Для цього культури клітин перед зараженням розглядають під мікроскопом, а потім відбирають пробірки з добре сформованим моношаром. Для дослідження однієї клінічної проби використовують 4—8 пробірок, таку саму кількість пробірок залишають для контролю клітин. Перед внесенням вірусвмісного матеріалу живильне середовище росту зливають, моношар промивають розчином Хенкса, пробірки маркують. У кожну пробірку вносять по 0,2 мл досліджуваного матеріалу і витримують у термостаті при температурі 37 °С протягом 1 год (для деяких вірусів – 2 год) для адсорбції вірусу на клітинах. Після 1–2-годинного контакту матеріал зливають, моношар промивають розчином Хенкса для видалення токсичних компонентів, заливають підтримувальним середовищем і витримують у термостаті при температурі 37 °С 7–14 днів до визначення результатів. Як підтримувальні можна використовувати середовище 199 з 2 % сироватки крові великої рогатої худоби (для ротавірусів – середовище 199 на розчині Ерла без сироватки), середовище Ігла з 2 % сироватки, розчин Ерла

з0,5 % гідролізатом лактальбуміну і 1–2 % сироватки крові.

Узаражених культурах клітин рН (6,9–7,4) підтримують за допомогою 7,5 % стерильного розчину натрію гідрокарбонату. Якщо культивування заражених культур тривале, то можна підтримувальне середовище замінити на свіже.

Цитопатична дія вірусів у культурах клітин. Різні віруси спричиняють неоднакові зміни у клітинах. Морфологічні зміни, що виникають під час взаємодії вірусу і клітини, називають цитопатичною дією (ЦПД), а віруси, які стають причиною цих змін, – цитопатогенними. Період розвитку і характер цитопатичних змін, спричинених цитопатогенними вірусами в інфікованих

23

культурах клітин, визначаються: 1) властивостями вірусу, 2) дозою вірусу; 3) властивостями клітин та умовами їх культивування.

Характерні для кожного вірусу цитопатичні зміни розвиваються в культурах клітин, заражених середніми дозами вірусу – 1000–10000 ЦПД50, (ЦПД50 – цитопатична доза вірусу, яка спричинює дегенерацію в 50 % пробірок із зараженою культурою клітин)с за умови яких процес загибелі клітин розтягується у часі. Якщо дози вірусу великі або малі, морфологічні зміни у клітинах бувають нетиповими: значні дози вірусів спричинюють розвиток некрозу з повним відшаруванням зруйнованих клітин від скла, а незначні – повільну осередкову дегенерацію клітин.

Виділяють три основні види змін у випадку зараження культур клітин:

1.Утворення багатоядерних гігантських клітин, синцитіїв і симпластів, що є результатом злиття цитоплазми багатьох клітин і амітотичного поділу.

2.Круглоклітинна дегенерація (пікноз, зморщування, деструкція клітин), що виникає внаслідок втрати міжклітинних зв'язків.

3.Розвиток осередків клітинної проліферації, що складаються з кількох шарів клітин.

Ступінь дегенерації клітин оцінюють знаком плюс: (4+) – деструкція всіх

клітин (100%); (3+) – більшості клітин (75%); (2+) – половини клітин (50%); Враховуючи ЦПД вірусів, слід пам'ятати про неспецифічну «вікову» дегенерацію клітин, яка спостерігається у старіючих культурах, а також про дегенерацію, зумовлену токсичною дією інокульованого матеріалу. Для виключення токсичної дегенерації клітин проводять додатковий пасаж: по 0,2 мл культуральної рідини з пробірок з дегенерованими клітинами вносять у пробірки із свіжими культурами клітин. Якщо дегенерація була зумовлена токсичним фактором випробовуваного матеріалу, то ЦПД у культурі клітин не розвивається.

Внутрішньоклітинні включення. Надзвичайно характерним для ЦПД багатьох вірусів є формування внутрішньоядерних і цитоплазматичних включень. Динаміка їх формування, їхні форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення, оскільки відрізняються у вірусів різних таксономічних груп.

Включення можна виявити в забарвлених або оброблених флюорохромами препаратах. Для цього культури клітин вирощують на скляних пластинках («літаюче скло») або пластинках з прозорої слюди, у пробірках або матрацах. Потім культури заражають вірусом, і через певні строки інкубації, залежно від властивостей інокульованого вірусу, готують препарати, забарвлюючи їх барвниками або флюорохромами.

Для вивчення включень можна приготувати відбитки органів і тканин, зскрібки клітин, гістологічні зрізи з ураженої тканини. У наш час у зв'язку з трудомісткістю й тривалістю приготування препаратів метод гістологічних зрізів використовують для виявлення внутрішньоклітинних включень дуже рідко, здебільшого для діагностики сказу.

Забарвлення препаратів. Універсальним є забарвлення за РомановськимГімзою у різних варіантах, під час якого виявляються всі види вірусних включень. Забарвлені за цим методом препарати фіксують у суміші Дюбоска-Бразіля-Буена

25

людини і тварин ця група вірусів безпечна, однак, вони завдають великих збитків сільському господарству у разі виникнення епіфітотій – масових уражень рослинних культур. Додатковою негативною ознакою цих вірусів є те, що разово заражена рослина назавжди лишиться інфікованою і стане джерелом поширення вірусу. У разі появи ознак зараження рослина підлягає обов’язковому знищенню для запобігання поширення вірусу.

Лабораторна робота 6

Виділення, культивування та індикація фітопатогенних вірусів

Мета: ознайомлення з основними правилами роботи з вірусами рослин: виділення з навколишнього середовища, пасажі на рослинах-індикаторах, отримання чистих ліній вірусу, способи інокуляції рослин вірусами, культивування їх на рослинах-господарях та рослинній культурі тканин

Матеріали та обладнання: віруси – ВТМ (вірус тютюнової мозаїки), ВЧК (вірус червоної конюшини) та інші віруси; рослини індикатори – тютюн, лебеда, квасоля, петунія та ніші; рослини-господарі – гвоздика, лебеда, тютюн та інші; абразивні речовини – карборунд і корунд, цемент, пензлики, піпетки, планшетки, штативи, пробірки, шпателі, фізіологічний розчин, ножиці, ступки з маточками, марля, холодильник, термостат, центрифуга, ураджені рослини з симптомами вірусної інфекції, ілюстративний матеріал (таблиці, рисунки).

Теоретичні відомості

І. Виділення та культивування вірусів рослин

Для культивування вірусів, в залежності від їх властивостей і від поставлених задач, використовують 4 типи рослин-господарів:

1)рослини, в яких вірус може зберігатися довгий час;

2)рослини, на яких легко виявляються симптоми, характерні для зараження даним вірусом;

3)рослини, з яких можна отримати великі кількості вірусу;

4)рослини, які використовують для оцінки інфекційності вірусу.

Для цих цілей використовують, як правило, різні види рослин. Так, наприклад, вірус мозаїки люцерни можна довгий час зберігати в люцерні, його найбільш високе накопичення спостерігається при культивуванні у тютюну, для визначення його ефективності використовують листя квасолі звичайної, а характерні симптоми, які відрізняють його від інших вірусів виявляються на тютюну, квасолі та Chenopodium amaranticolor.

Метод механічної інокуляції. Метод механічної інокуляції – найбільш поширений в лабораторній практиці спосіб засіб передачі вірусів здоровій рослині.

При механічній передачі інфекційний вірус (або його РНК) вводиться в

клітину через пошкодження (мікротравми) кутикули листя, що викликається застосуванням при інокуляції абразивом. Дрібні (400-700 мкм) абразивні порошки діатомових водоростей (наприклад, "целіт") є найбільш ефективним матеріалом для цієї операції. Для механічної інокуляції поверхня листя опилюється

26

абразивним порошком, потім наноситься 1-2 краплі вірусної суспензії на оброблену абразивом поверхню і за допомогою скляної палички або пластикової петлі інокулят разом з аброзивом рівномірно розподіляється на поверхні ураженого листя. Цю операцію необхідно виконувати з врахуванням багатьох факторів: виду рослини, віку та стану листя, якості абразивного порошку та інших.

Методом механічної інокуляції краще всього передаються віруси, які достигають в рослинах високої концентрації та здатні уражати як епідерміс, так і інші тканини. До цієї категорії відносяться віруси, що викликають мозаїку, крапчатість або кільцеву плямистість. Після певного часу з моменту зараження чутливих до вірусу видів рослин можуть розвитися симптоми інфекції.

Віруси здатні заражати на тільки цілий організм господаря, але його окремі клітини, які вирощують у культурі (але і культурі клітин). Ціла клітинна оболонка рослин не доступна для вірусів і, якщо таку рослину обробити препаратом вірусу, зараження не відбудеться. Але, якщо зруйнувати клітинну оболонку рослини пектиназами і целюлазами, то отримані протопласти легко заражаються вірусом при додавання його у середовище для культивування протопластів. Протопласти використовують для культивування вірусів тютюнової мозаїки, огіркової мозаїки, Х- вірусу картоплі та інші.

ІІ. Ідентифікація та титрування фітопатогенних вірусів

Різні види рослин-хазяїв реагують на інфекцію по-різному. Характер реакції рослини залежить від її генетичної природи і від типу інфекції, якої заражають рослину. Відрізняють 4 основних типи реакції рослини на зараження їх вірусом:

1)імуність – рослина не заражається даним вірусом;

2)зверхчутливість – рослина заражається з утворенням уражень (некрозів), які з‘являються в наслідок відмирання клітин навколо точки зараження;

3)толерантність – вірус розповсюджується по тканинам рослини, але симптоми захворювання виражені слабо;

4)системні ураження – вірус розповсюджується по всім тканинам рослини з яскраво вираженими симптомами захворювання.

Симптоми захворювання можуть бути різними: мозаїка, деформація листя, просвітління жилок, утворення хлоротичних плям різної форми. між цими типами реакції рослини на вірусну інфекцію іноді відсутні чіткі межі. Наприклад, тяжко відрізнити реакцію толерантності і системного ураження. У деяких рослин після механічної інокуляції спочатку утворюються некрози (зверхчутливість), далі рослини уражуються системно.

Але при вірному підборі рослин -хазяїв, а також при певних умовах інокуляції та культивування інфікованих рослин можливо отримати чіткі характерні картини інфекції.

Для кожного з вивчених вірусів можна підібрати набір рослин, які будуть специфічно редагувати на інфекцію (рослини – індикатори вірусу). Різні штами вірусу можуть відрізнятися по набору чутливих рослин-хазяїв або викликати різні типи реакції при ураженні рослин-індикаторів. Так наприклад, штам Vulgare ВТМ викликає системну реакцію на рослинах Nicotiana sylvestris L., та Nicotiana tabacum

27

L. var Samsun EN, в той час як інші штами ВТМ викликають на цих рослинах некротичну реакцію.

Таким чином, при використанні набору рослин-індикаторів, можливо ідентифікувати даний вірус та визначити його в суміші з іншими вірусами. Такий метод ідентифікації вірусів називається візуальний.

Для ідентифікації вірусу за допомогою набору різних рослин індикаторів виконують такі операції:

1.Вимити руки, робочу поверхню стола, інструменти, роботи проводити на чистому листі фільтрувального паперу.

2.За допомогою механічної інокуляції проводять зараження 2-3 листків рослини глютинози, дурману, хеноподіуму, ячменю, квасолі.

3.Залишок вірусного препарату змивають дистильованою водою.

4.Спостерігають за станом рослини протягом 12 діб з моменту зараження; визначають симптоми інфекції та час з‘явлення симптомів. Ідентифікацію вірусів проводять на основі характеру уражень індикаторних рослин або відсутності інфекції у імунних до даного вірусу рослин.

Для перевірки результатів, отриманих за допомогою візуального методу, використовують серологічні реакції з антисироватками до кожного із визначених вірусів та екстрактами рослин з системною інфекцією. Аглютинація хлоропластів

–найпростіший тест для вірусів рослин. Краплю антисироватки або нормальної сироватки змішують з краплею соку зараженої рослини. Якщо вірусні частки вступають в реакцію з антисироваткою, то відбувається аглютинація хлоропластів. Для титрування вірусних антигенів широко використовують серологічний тест – аглютинація. Для проведення цього тесту вірусний антиген у різних розведеннях змішують з одним і тим ж розведенням антисироватки і спостерігають утворення преципітату. Визначають оптимальне співвідношення концентрації антигену до антитіл при якому найшвидше утворюється преципітат та кінцеве розведення антигену, при якому можливе утворення видимого преципітату.

Серед мікроскопічних методів виявлення вірусів в рослинних клітинах широко використовується метод люмінесцентної та електронної мікроскопії. Використання флуорохрому – акридина помаранчевого дозволяє виявити локалізацію та тип нуклеїнової кислоти.

Для дослідження ультраструктури інфікованих вірусами клітин використовують методику: фіксують невеликий шматочок тканини визначеними хімічними речовинами (наприклад чотириокис осмію), обезводжують, домішують епоксидну смолу, за допомогою скляного ножа зразок ріжуть на шматочки товщиною 50-100 нм і зрізи обробляють солями урану або свинцю та досліджують в електронному мікроскопі.

Мірою інфекційності вірусного препарату є визначення долі інфікованих клітин або час появи симптомів інфекції. В першому випадку, відносно невелика кількість вірусних часток контактує з клітинами рослин, інфікується незначна кількість клітин з утворенням некротичних уражень. Кількість уражень на кожному листі залежить від концентрації вірусу в інокуляті. У другому випадку, коли рослина інфікується одночасно кількома дозами вірусу, за міру концентрації вірусу використовують, залежний від дози, кількісний параметр інфекційного

28

процесу – час появи симптомів.

Контрольні питання

1.Поясніть терміни рослини-індикатори, рослини-господарі.

2.Охарактеризуйте поняття: «чиста лінія вірусу», «дикий вірус».

3. Основні методи зараження рослин вірусом. Переваги та недоліки цих методів. Для чого використовують абразиви.

4. Рослинна культура, її основні властивості. Для який цілей вона використовується в фітовірусології.

5. Методи ідентифікації вірусів, їх суть.

6. Якими методами можливо відрізнити вірусну інфекцію від бактеріальної на рослинах. Назвіть основні симптоми вірусної інфекції. Назвіть основні типи реакції рослини на зараження їх вірусами.

7. Вірусні включення, їх природа, місце локалізації, форма, характер.

ТЕМА 4. РОБОТА ІЗ ВІРУСАМИ БАКТЕРІЙ

Бактеріофаги – віруси бактерій. Їм притаманні виражені паразитичні властивості, що обумовлюють їх існування і розмноження тільки в культурах гомологічних мікроорганізмів. На цій основі наявність бактеріофага можна розглядати як непрямий показник інфікованості досліджуваного матеріалу відповідним мікробом.

Фаги можна розглядати і як корисні для людини віруси, і як шкідливі форми. Корисними фаги є для діагностики та лікування цілого ряду захворювань, у генетичній інжеенрії тощо. Шкідливими фаги є для мікробних виробництв, де знищують культури мікроорганізмів-продуцентів і зупиняють отримання цільового пордукту.

Лабораторна робота 7

Титрування фагів

І. Титрування фагів за методом Апельмана

Мета: оволодіти методикою титрування фагів за методом Апельмана. Матеріали та обладнання: колби (50, 250 мл), чашки Петрі, піпетки (1 мл),

пробірки, МПБ, термостат, добові культури B. megaterium, B. mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, B. thuringiensis, B. brevis, фаголізат.

Теоретичні відомості

Титр бактеріофага можна визначити за ступенем максимального розведення досліджуваного фаголізату, за якого ще спостерігається повний лізис чутливої до нього бактеріальної культури. Отриману величину виражають негативним десятковим логарифмом, де степінь вказує на розведення фага. Такий спосіб титрування проводять у рідкому середовищі за методом Апельмана.

Метод Апельмана заснований на внесенні різних кількостей титрованого

29

бактеріофага в бульйон, засіяний однією і тією ж дозою культури гомологічних мікробів, з метою отримання феномена бактеріофагії.

Хід роботи

1.Для експерименту беруть чисту лінію фага, отриману в ході попередньої лабораторної роботи. Дванадцять пробірок, що містять по 4,5 мл МПБ, ставлять у штатив у ряд. У першу пробірку стерильною піпеткою вносять 0,5 мл досліджуваного концентрату фага. Вміст пробірки перемішують новою піпеткою і 0,5 мл рідини переносять у другу пробірку, з другої – в третю і так далі до десятої включно. Із десятої пробірки зайві 0,5 мл виливають у дезінфекційний розчин. Одинадцята і дванадцята пробірки – контрольні.

Кожне перенесення рідини з однієї пробірки в іншу здійснюють окремою

стерильною піпеткою місткістю 1 мл. Таким чином, у 10 пробірках отримують розведення бактеріофага від 10-1 до 10-10.

2.У всі 10 пробірок приготованого ряду розведень вносять по 0,1 мл суспензії змиву добової агарової або бульйонної культури, яка містить 1·109 мікробних клітин у 1 мл (відповідність стандарту каламутності 10 од.). Використовують бактерії, гомологічні титрованому фагу. Додавана суспензія клітин не повинна містити стійких до фагу клітин.

Одинадцята пробірка – контроль культури. Вона містить 5 мл бульйону і 0,1 мл бактеріальної культури. Дванадцята пробірка – контроль на стерильність, містить 5 мл бульйону без додавання бактерій і фага. Усі пробірки струшують, штатив із ними поміщають у термостат і інкубують за температури 29ºС 18 – 20 год.

3.Облік результатів проводять одразу після інкубації. Титром вважають те максимальне розведення бактеріофага, за якого спостерігається повний лізис чутливої до нього культури. Практично це відповідає останній пробірці в ряді, у якій бульйон ще залишатиметься абсолютно прозорим.

4.Розраховують титр фага і вносять його у висновки. Зарисовують ряд пробірок.

ІІ. Титрування фагів за методом Граціа

Мета: засвоїти методику титрування фагів за методом Граціа.

Матеріали та обладнання: колби (50, 250 мл), чашки Петрі, піпетки (1 мл), пробірки, МПА та МПБ з 0,4% глюкози і 0,02% CaCl2, термостат, добові культури

B. megaterium, B. mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, B. thuringiensis, B. brevis,

фаголізат.

Теоретичні відомості

Метод титрування вірусів бактерій на агаризованих середовищах запропонував бельгійський вчений Андре Граціа в 1936 р. для визначення кількості активних фагових часток у одиниці об’єму вихідного фаголізату. Такий