Лекция 7
.pdf
ВИРУСОЛОГИЯ
Лекция № 7
Лекции для студентов III курса
Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова
Бактериофаги
скольцевой однонитевой
(ss)ДНК
1
10.04.2013
семейство Microviridae
•фаги φХ174, S13, G4.
икосаэдрический белковый капсид (d -25 нм)
ssДНК ~ 6 000 нт
лизируют бактериальную клетку
Группа II
2
семейство Inoviridae
Бактериофаги М13, fd.
нитевидный капсид, спиральная симметрия
(l ~1000нм; d – 6-9 нм) 
Gene 7 protein
Gene 9 protein
бактериофаг М13 |
Circular ssDNA |
Gene 8 protein |
ssДНК ~ 6 500 нт
Не лизируют
Gene 6 protein
бактериальную клетку |
Gene 3 protein |
Группа II
3
1
семейство Microviridae
бактериофаг φХ174
(H)
(J)
F – ГРАНИ ИКОСАЭДРА (60 мол. в капсиде, 3 - на грань) G – ВЕРШИНЫ ИКОСАЭДРА (5 мол. на вершину)
H – ВЕРШИНЫ ИКОСАЭДРА (1 мол. на вершину) J – ВНУТРЕННИЙ БЕЛОК
4
|
Геном фага φX174 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
F, H, G, J – |
|
6 тыс. нукл., |
|
|
СТРУКТУРНЫЕ БЕЛКИ |
|
11 белков |
|
|
A – РЕПЛИКАЦИЯ ДНК |
|
|
|
|
||
|
|
|
A* – ПОДАВЛЕНИЕ СИНТЕЗА |
|
G |
|
|
КЛЕТОЧНОЙ ДНК |
|
|
B |
|
||
φX174 |
B, C, D – ОБРАЗОВАНИЕ |
|||
|
||||
|
|
K |
ВИРИОНА (прокапсида) |
|
F |
|
|
||
C |
|
E – ЛИЗИС КЛЕТКИ |
||
|
|
|||
J |
D |
|
К – ПОВЫШАЕТ ВЫХОД ФАГА |
|
|
E |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
10.04.2013
ПЕРЕКРЫВАНИЕ ГЕНОВ В ГЕНОМЕ БАКТЕРИОФАГА φХ174
|
B |
E |
|
A (A*) |
|
C |
D |
|
K |
|
|
Ген B |
PheTer |
(n-1) |
|
Ген А |
SerAspGlu |
(n) |
|
Ген K |
fMetLys |
(n+1) |
|
|
TTCTGATGAAA |
|
|
6
РЕПЛИКАЦИЯ КОЛЬЦЕВОЙ SS ДНК
|
|
ДНК-связыв.= Single Strand Binding protein |
|
||||
|
|
белок |
SSB |
3’ 5’ |
|
||
Фаг |
|
|
РНК |
||||
|
|
+ДНК |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|||
G4 |
|
|
|
|
|
затравка |
|
|
|
+ДНК |
-ДНК |
||||
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
ДНК |
|
|
|
|
|
|
|
ПОЛИМЕРАЗА |
|
|
|
УДАЛЕНИЕ ЗАТРАВКИ: |
III |
|||
|
|
|
|
||||
|
- |
+ |
РИБОНУКЛЕАЗА Н |
|
|
|
|
|
ДНК ПОЛИМЕРАЗА I |
|
|
|
|
||
РФI |
|
ДНК ПОЛИМЕРАЗА III |
|
|
|
|
|
|
ДНК ЛИГАЗА |
|
|
|
|
||
СУПЕРСКРУЧИВАНИЕ |
ТРАНСКРИПЦИЯ РФI, |
||||||
|
ДНК РФI: |
|
ТРАНСЛЯЦИЯ мРНК |
||||
ТОПОИЗОМЕРАЗА II
I. на + ДНК образуется ± ДНК |
7 |
|
2
РЕПЛИКАЦИЯ РОДИТЕЛЬСКИХ, ПРОДУКЦИЯ ДОЧЕРНИХ РФ
3’ |
3’ |
II. на ± ДНК образуется ± ДНК
10.04.2013
Сборка вириона φХ174
CТРУКТУРНЫЕ БЕЛКИ: F, G, H, J НЕСТРУКТУРНЫЕ БЕЛКИ: A,B,C,D,E,K,A*
B+D
неструктурные белки
FGH
структурные белки
прокапсид
8 |
10 |
Белки, участвующие в репликации
ФАГОВЫЙ:
А-белок (белок II у М13 и fd)
КЛЕТОЧНЫЕ: SSB (ДСБ)
РНК-полимераза II (M13 и G4) или праймосома (φX174) ДНК-полимераза III
рибонуклеаза Н и ДНК-полимераза I ДНК-лигаза хеликаза
Завершение репликации
накопление структурных белков;
белок J связывает дочерние (+)цепи ДНК; начинается упаковка дочерних цепей в вирионы.
Сборка вириона φХ174
G
9 |
11 |
3
Сборка вириона φХ174
Дочерний РФII вирус.
–
+ +
–
+
+
III. на - ДНК образуется + ДНК
Этапы репликации фага
I. на + ДНК образуется ± ДНК II. на ± ДНК образуется ± ДНК III. на - ДНК образуется + ДНК
10.04.2013
Бактериофаги, содержащие двунитевую
(ds) ДНК
12 |
13 |
|
|
|
|
Порядок Caudovirales |
|
ЦИКЛ |
|
|
• |
Сем. Podoviridae ( от греч. “pous”, |
|
РЕПЛИКАЦИИ |
|
|
нога). |
||
φХ174 |
|
|
|
Роды: Т7,Т3- подобные бактериофаги; |
|
|
|
|
N4- подобные бактериофаги и др. |
||
|
|
|
|
||
|
|
|
• |
Сем. Myoviridae ( от греч.”myos”, |
мышца- |
|
|
|
|
аналогия с сокращающимся хвостовым отростком |
|
|
|
|
|
фага). |
|
|
|
|
|
Роды: Т4-подобные бактериофаги и др. |
|
|
|
|
• |
Сем. Siphoviridae |
Группа I |
|
|
|
|
||
|
|
|
|
cauda (лат.) - «хвост» |
|
|
13 |
|
|
|
13a |
4
Сем. Podoviridae
Электронные микрофотографии бактериофага Т7
14
БАКТЕРИОФАГ Т7
вирион Т7: - икосаэдрическая головка Ø 50 нм,
-полый отросток 15 нм (не способный к сокращению)
-фибриллы
геном Т7: - двунитевая линейная ДНК (~40 тыс. нукл. пар) - прямые концевые повторы 160 нукл. пар
проникновение в клетку – по внутреннему каналу отростка
15
10.04.2013
Модификация и рестрикция ДНК
-фаговая ДНК в клетке может быть разрушена нуклеазами
-геномы бактерий кодируют набор эндонуклеаз и соответствующих им метилаз
↓ |
|
CH3 |
|||
5’-GAATTC- |
EcoRI |
5’-GAATTC- |
|||
-CTTAAG-5’ |
-CTTAAG-5’ |
||||
|
|||||
↑ |
|
|
|
|
|
|
|
CH3 |
|||
|
|
|
|||
-существует >400 рестриктаз, узнают >100 сайтов
-основа для генетической инженерии
16
Сем. Podoviridae
БАКТЕРИОФАГ Т7
Истинно ранние
(early) гены: 0.3-1.3. 4-8 мин.
Отложено ранние
(delayed early)
гены:
2.0-6.0.
6-15 мин.
Поздние (late)
гены:7.0-19.0 (8-30 мин.).
17
5
10.04.2013
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КАРТА бактериофага Т7.
|
|
L |
РЕГУЛЯЦИЯ |
СИНТЕЗ ДНК |
|
СТР. БЕЛКИ, СБОРКА |
L |
|
|
||||
|
|
|
3 |
||||||||||
5’ |
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
0.3 |
0.7 1.0 1.3 |
2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 |
7.0 |
19.0 |
|||||||||
|
|
|
5 |
||||||||||
3’ |
|||||||||||||
R |
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
R |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
0.3 |
– |
АНТИРЕСТРИКЦИЯ; |
|
|
|
|
|
|
|||||
0.7 |
– |
ПРОТЕИН КИНАЗА; |
|
БЕЛКИ ГОЛОВКИ, |
|||||||||
1.0 |
– |
Т7 РНК ПОЛИМЕРАЗА; |
|
||||||||||
|
ХВОСТОВОГО |
||||||||||||
1.3 |
– |
ДНК ЛИГАЗА; |
|
||||||||||
2.0 |
– |
ИНГИБИТОР; |
ОТРОСТКА, БЕЛКИ |
||||||||||
3.0 |
– |
ЭНДОНУКЛЕАЗА; |
|
СОЗРЕВАНИЯ |
|||||||||
4.0 |
– ХЕЛИКАЗА-ПРАЙМАЗА; |
|
|||||||||||
|
ВИРИОНА |
||||||||||||
5.0 |
– |
T7 ДНК ПОЛИМЕРАЗА; |
|
||||||||||
6.0 |
– |
ЭКЗОНУКЛЕАЗА |
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
18 |
ТРАНСКРИПЦИЯ ГЕНОВ бактериофага Т7 |
|||||
I |
|
|
II |
|
III |
P1’P1’’P1’’’ |
T |
1 |
T2 |
|
T3 |
P2 ’ |
P2’’ P2’’’ |
P3 ’ |
P3’’ |
||
0.3 |
1.3 |
|
10 11 12 13 |
19 |
|
(1) 4-8 мин. |
|
|
(2) 6-15 мин. |
(3) 8-30 мин. |
|
|
|
|
|
|
19 |
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК бактериофага Т7
РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА
ЛИДИРУЮЩАЯ ЦЕПЬ
ОТСТАЮЩАЯ ЦЕПЬ
ЗАТРАВКА фрагмент ОКАЗАКИ
20
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК бактериофага Т7
5’ |
А |
|
|
|
|
|
ORI |
|
А |
3’ |
||||||||||||
3’ |
а |
|
|
|
|
|
|
а |
5’ |
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВытеснениеРНК |
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
полимеразы |
|
|
5’ |
|
|
Репликативная |
1.0 Т7 РНК полимераза |
||||||||||||||||||
|
|
|
4.0 - хеликаза-праймаза |
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
вилка |
|||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
Фрагменты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3’ |
2.5 - ДНК-связывающий |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
белок (SSB) |
||||
Оказаки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5’ |
5.0 - Т7 ДНК полимераза |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
’ |
|||
5’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
РНК-ЗАТРАВКИ (pppACCCA) |
|
|
|||||||||
3’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Дочерние цепи с |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
недостоенными 5’-концами |
|
|
||||||||||
А |
|
|
|
А |
|
|
|
5’ |
|
|
|
|
|
|
|
А 3’ |
|
|
||||
5’ |
|
|
|
|
|
3’ |
|
|
||||||||||||||
3’a |
|
|
|
|
|
5’+ 3’ a |
a5’ |
|
20а |
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
’ |
|
|
6
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК бактериофага Т7
синтез лидирующей цепи
ДНК - полимераза
тиоредоксин (белок клетки)
Хеликаза-праймаза
ssДНК – связ. белок
синтез отстающей цепи ДНК - полимераза
20в
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Т7
5’ А |
|
|
|
|
|
|
|
ORI |
|
А |
3’ |
||||||||||
3’ а |
|
|
|
|
|
|
|
|
а |
5’ |
|||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ВытеснениеРНК |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
полимеразы |
|
|
5’ |
Репликативная |
1.0 Т7 РНК полимераза |
|||||||||||||||||||
|
|
|
4.0 - хеликаза-праймаза |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
вилка |
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
Фрагменты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3’ |
2.5 - ДНК-связывающий |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
белок |
|
|
||||
Оказаки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5’ |
5.0 - Т7 ДНК полимераза |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
’ |
|||
5’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
РНК-ЗАТРАВКИ (pppACCCA) |
|
|||||||||||||
3’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Дочерние цепи с |
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
недостоенными 5’-концами |
|
|
||||||||||
А |
А |
|
|
|
5’ |
|
|
|
|
|
|
|
А 3’ |
|
|
||||||
5’ |
|
|
3’ |
|
|
||||||||||||||||
3’a |
|
|
5’+ 3’ a |
a5’ |
|
20с |
|||||||||||||||
|
|
|
|||||||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10.04.2013
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК бактериофага Т7
5’ |
|
А |
А |
|
А |
3’ |
Удаление затравок. |
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
’a |
a |
|
a |
|
|
|
|||||||
5’ A |
A |
|
|
A 3’ |
Застройка брешей, |
|
||||||||
3’ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
5’ |
|
лигирование, |
|
|
a |
|
|
a |
|
|
a |
вырезание мономеров. |
|||||||
|
|
|
A |
|
3’ |
A |
|
|
|
A |
Достройка 3’- концов |
|||
|
|
|
|
3’ |
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
a |
|||||
|
|
|
a |
a |
|
|
|
|
( |
) |
||||
|
|
|
A |
A |
A |
|
|
|
A |
|
|
|||
|
|
|
a |
a |
+ a |
|
|
|
a |
|
|
|||
Образование двух геномов-мономеров
21
Порядок Caudovirales
сем. Myoviridae
Т4 бактериофаг
Бактериофаги с сокращающимся хвостовым отростком
22
7
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
10.04.2013 |
Т4 бактериофаг |
|
|
|
Бактериофаг T4 |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Особенность вириона: |
||||
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
- сокращающийся отросток |
|||
|
|
|
|
|
|
|
Особенности генома: |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
- модификация нт оснований |
|||
|
|
|
|
|
|
|
- концевая избыточность |
|||
|
|
|
|
|
|
|
- кольцевые перестановки |
|||
|
|
|
|
|
|
|
- следствие упаковки |
|||
|
|
|
|
|
|
|
дочерних геномов по |
|||
|
|
|
|
|
|
|
механизму HEAD-FULL |
|||
Электронные микрофотографии бактериофага Т4 |
123456789101234567891012345678910123456789 |
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
23 |
|
|
|
|
|
|
|
|
25 |
Т4 бактериофаг |
|
|
|
CХЕМА ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ |
||||||
И МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ РНК ПОЛИМЕРАЗЫ |
||||||||||
|
|
|
|
ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ФАГОМ Т4 |
|
|||||
|
|
ПрР |
|
ТРПрср |
|
|
ТсрПрП |
|
|
Тп |
|
|
ПрР;СР;П – промотеры ранних, средних и поздних |
||||||||
|
|
генов. |
Т- соответствующие терминаторы.A |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
A |
|
|
|
|
σ |
β |
|
σ |
|
β |
σ |
|
β |
α |
|
α |
|
α |
α |
|
|||||
|
|
|
|
α |
|
|
|
|||
|
|
α |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
A |
|
|
A |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
24 |
A- аденилат; АДФ-рибозильные остатки |
|
26 |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
8 |
10.04.2013
Лизис клетки E. coli бактериофагом Т4
27
Схематическое изображение основных видов вирусов, заражающих бактерии -
бактериофагов
28
9