Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

олигосахарид в положении Asn 8 и 12 участков О-гликозилирования. Второй домен – трансмембранный гидрофобный (позиции 58–81), третий домен – цитоплазматический С-терминальный (позиции 82–128) (Colin и соавт. [19], High, Tanner [38]). Цитоплазматический домен гликофорина С связан с цитоскелетоном. N-терминальный участок ассоциирован с трансмембранными гликофоринами А и В.

Аминокислотная последовательность гликофорина D определена частично, поскольку N-терминальный участок его блокирован (El-Maliki и соавт. [32]). Гликофорин D представляет собой укороченный вариант гликофорина С без N-терминальной последовательности из 21 аминокислоты. Он идентичен гликофорину С по аминокислотам в позициях 22–128.

Гликофорин D не имеет участков N-гликозилирования, поскольку не содержит N-терминального домена (Dahr и соавт. [21]). Антиген Ge3, представленный аминокислотной последовательностью в позициях 40–50 на гликофорине С, присутствует также на гликофорине D (High и соавт. [39]);

Антигенные детерминанты, распознаваемые ксеногенными моно- и поликлональными антителами, расположены на цитоплазматических доменах гликофоринов С и D (El-Maliki и соавт. [32], King и соавт. [48], Reid и соавт. [94]).

Структура гена GYPC

Несмотря на высокую степень гомологии гликофоринов С и D, гомолог гена GYPC на уровне кДНК идентифицировать не удалось. Это свидетельствует о том, что самостоятельного гена, контролирующего синтез гликофорина D, не существует. Оба типа гликофоринов кодирует один и тот же ген GYPC (Le Van Kim и соавт. [52], Tanner и соавт. [120]). Как установи-

ли Tanner и соавт., различия гликофоринов С и D обусловлены мутацией иРНК гена GYPC, в результате чего трансляция начинается с двух разных точек, соответственно, синтезируются два гомологичных полипептида разной длины.

Структура гена GYPC и схема его функционирования исследованы

(рис. 20.2–20.5, табл. 20.2).

Рис.20.2.ГенетическаякарталокусаGYPC (поReid,Lomas-Francis[97]).

781

Рис. 20.3. Схема синтеза гликофоринов С и D геном GYPC из двух стартовых точек

(по Daniels [24]).

Трансляция начинается с AUG-кодона (метионина), представленного в ДНК триплетом AЕG. Вновь синтезированные полипептиды имеют метионин в N-области, хотя последний отщепляется от зрелого протеина. Последовательность РНК вблизи стартового кодона гликофорина С (CCAGGAAUGU) отдалена от стартовой последовательности (CC(A / G) CCAUGG). Последовательность (CCGGGGAUGG) кодона метионина в позиции 22 на гликофорине С находится ближе к стартовому участку (Tanner и соавт. [120]). Таким образом, первая стартовая точка (для метионина в позиции 1),

782

с которой начинается трансляция, иногда не считывается. Второй участок, с которого может начаться трансляция, кодирует метионин в позиции 22. В этом случае синтезируется гликофорин D, который, как отмечалось выше, идентичен гликофорину С в позициях 22–128 (см. рис. 20.3). Возможность двух вариантов трансляции одного и того же гена подтверждена экспериментами с трансфекцией кДНК GYPC в клетки COS-7. Указанные клетки продуцировали оба типа гликофоринов. Трансфекция этой линии кДНК с делециямиATG (кодона метионина) приводила к продукции только гликофорина D. В случае заменыATG на ACG в позиции 22 синтезировался гликофорин С. В случае замены обоих кодоновATG в позициях 1 и 22 гликофорины не синтезировались. Мутация в нуклеотиде 4 (ATG T →ATG G) повышала экспрессию гликофорина С в 2 раза по сравнению с выраженностью гликофорина D (Le Van Kim и соавт. [54]).

Ген GYPC представлен четырьмя экзонами общей протяженностью 13,5 кб

(см. табл. 20.2, рис. 20.2) (Colin и соавт. [18], High и соавт. [39]).

Экзоны 1–3 кодируют экстрацеллюлярные домены гликофоринов С и D, экзон 4 – трансмембранный и цитоплазматический домены. Экзоны 2 и 3 имеют высокую степень сходства, что объясняется происхождением экзонов путем дупликации, хотя при этом экзон 3 содержит вставочную последовательность из 27 пар нуклеотидов, которой нет в экзоне 2. Указанная вставка кодирует аминокислоты в позициях 42–50 гликофорина С (Colin и соавт. [16]), Le Van Kim и со-

авт. [53]).

На рис. 20.4 и 20.5 представлена схема неравновесного кроссинговера и варианты гена GYPC, приводящие к возникновению редких антигенов и феноти-

пов Gerbich.

Рис. 20. 4. Неравновесный кроссинговер, приводящий к возникновению необычных вариантов гена GYPC (по Daniels [24]).

783

Рис. 20.5. Организация редких вариантов гена GYPC (по Daniels [24]).

Часто встречающиеся антигены Gerbich

В 1960-х годах полагали, что существует один антиген Gerbich, выявляемый сывороткой миссис Gerbich и двумя другими однотипно реагирующими сыворотками. Этот антиген был описан Rosenfield и соавт. [106] и позднее получил обозначение Ge3. В 1961 г. Barnes и Lewis [6] нашли еще один антиген этой системы – Ge2, выявляемый сывороткой миссисYussef. И наконец, в середине 80-х го-

дов Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [26], McShane и Chung [67] обнаружили антитела, идентифицирующие третий часто встречающийся антиген – Ge4.

Ge2, Ge3 и Ge4

Как установили Barnes и Lewis [6], эритроциты миссис Yussef, жительницы Кипра турецкого происхождения, агглютинировались сывороткой Gerbich, но не реагировали с сыворотками анти-Ge, полученными от других лиц Ge −. Сыворотка миссис Yussef содержала антитела, реагировавшие со всеми

784

образцами эритроцитов за исключением собственных эритроцитов и эритроцитов трех ранее найденных Ge-отрицательных лиц. Адсорбция сыворотки Gerbich эритроцитами Yussef полностью устраняла ее активность. Таким образом, с помощью двух разнореагирующих сывороток (Gerbich и Yussef) были идентифицированы два антигена системы Gerbich.

Обследование жителей Папуа – Новой Гвинеи позволило получить новые данные об этой системе. Booth и соавт. [10, 11] нашли Gerbich-ассоциированные антитела у меланезийца Ge +, которые не реагировали с эритроцитами лиц, имевших фенотипGerbichиYus,атакжесэритроцитами15 %меланезийцевGe +.Сталоочевидным, что существует третья разновидность анти-Ge-антител, с помощью которой можно идентифицировать три Ge-отрицательных фенотипа, каждый из которыхлишенодногоизтрехантигенов,составляющихсистемуGerbich(табл.20.3).

Таблица 20.3

Редкие фенотипы Gerbich

Однако эритроциты меланезийца Ge: −1, 2, 3 и его анти-Ge1-сыворотка вскоре стали недоступны. Соответственно, меланезийский вариант Gerbichотрицательного фенотипа (Ge: −1, 2, 3) и анти-Ge1-антитела не вошли в классификацию и больше не используются (Booth и соавт. [11, 61], Daniels [24]).

Anstee и соавт. [5] и Daniels и соавт. [26] обнаружили, что некоторые исследованные ими моноклональные антитела обладали Gerbich-ассоциированной специфичностью. Эти антитела реагировали со всеми образцами эритроцитов Ge + и Ge −, включая эритроциты Ge: −2, −3. В то же время были найдены образцы эритроцитов Ge: −2, −3, которые не реагировали с Gerbichассоциированными МКА (Anstee и соавт. [4, 5]). Этот Gerbich-отрицательный фенотип получил название Leach. Антитела, имевшиеся у миссис Leach, давали реакции, сходные с реакциями Gerbich-ассоциированных МКА. Антиген, открываемый ими, получил обозначение Ge4 (McShane, Chung [67]). Фенотип Leach обозначен в цифровой номенклатуре как Ge: −2, −3, −4. Все другие образцы эритроцитов содержат антиген Ge4 (см. табл. 20.3).

Посредством иммуноблоттинга с использованием нескольких образцов анти- Ge2-антител показано, что антиген Ge2 распологается на гликофорине D (рис. 20.6). Гликофорин С не содержит этот антиген (Dahr и соавт. [22], Reid и соавт. [94]). Эпитопы Ge2 расположены на N-терминальном пептиде гликофорина D (аминокислоты в позициях 1–27) (Dahr и соавт. [22]). Обработка эритроцитов трипсином или папаином разрушает антиген Ge2, в то время как химотрипсин и проназа на него не действуют (Daniels [25]). Примерно половина образцов анти-Ge2-антител реагироваласлабеесэритроцитами,обработаннымисиалидазой(Daniels[25]).

785

Поскольку гликофорин D является укороченным аналогом гликофорина С анти-Ge2-антитела могут распознать аминокислотную последовательность, если она находится на N-терминальном участке гликофорина D, но не на гомологичном участке гликофорина С. Вместе с тем в образовании эпитопа Ge2 могут участвовать свободные аминогруппы гликофорина D. Некоторые образцы анти-Ge2- антител не реагируют с эритроцитами, обработанными уксусным ангидридом. Это дает основание полагать, что аминогруппы также вовлечены в формирование эпитопов, распознаваемых анти-Ge2-антителами. Анти-Ge2-антитела, повидимому, являются гетерогенными и распознают эпитопы на разных участках гликофорина D, в том числе на N-терминальном участке (Daniels и соавт. [28]).

Подобно антигену Ge2, антиген Ge3 разрушается трипсином. К химотрипсину и проназе он устойчив. В отличие от Ge2 антиген Ge3 устойчив к действию папаина (Mohammed и соавт. [70]). Соответственно эритроциты, обработанные папаином, можно использовать для дифференциации антител анти-Ge2 от антиGe3 при отсутствии эритроцитов редкого фенотипа Ge: −2, 3, 4.

Методом иммуноблоттинга с МКА было показано, что эпитопы Ge3 локализуются на гликофоринах С и D (рис. 20.6) (Dahr и соавт. [22], Loirat и соавт. [56, 57], Reid и соавт. [94], Smythe и соавт. [115]). Аллоиммунные анти-Ge3-антитела удавалось элюировать с гликофоринов обоих типов (Reid и соавт. [94]).

АнтигенGe3кодируетсяэкзоном3GYPC.Приделецииуказанногоучасткаантиген Ge3 отсутствует. Делеция экзона 2 не приводит к исчезновению экспрессии Ge3. Экзоны 2 и 3 имеют большое сходство и различаются лишь вставкой из 27 нуклеотидов, кодирующих аминокислоты в позициях 42–50 на гликофорине С и 21–29 – на гликофорине D, поэтому эпитопы Ge3 присутствуют именно в указанных областях соответствующих гликофоринов (Dahr и соавт. [22]).

Антиген Ge4 располагается в N-терминальной части гликофорина С (см. рис. 20.6). На гликофорине D он отсутствует (Anstee и соавт. [4, 5], Dahr и

соавт. [21], Daniels и соавт. [29]).

ДетальныйанализспецифическихМКАпоказал,чтонекоторымизнихдлясвязывания эпитопами Ge4 требовалась аминогруппа в позиции Met1 на гликофорине С.ВтожевремядругиеМКАраспознавалиэпитопысредипервых20аминокислот гликофоринаСиMet1вреакциювовлеченнебыл(Ansteeисоавт.[5],Dahrисоавт. [21]). Более значимым для связывания антител оказалось О-гликозилирование гликофоринаС.АнтигенGe4разрушаетсятрипсиномипапаином.

Фенотип Gerbich-нуль

Gerbich-отрицательные фенотипы у европеоидов крайне редки. При обследовании более 45 тыс. европейцев Gerbich-отрицательный фенотип выявлен лишь у одного (табл. 20.4). Существенно чаще люди, лишенные антигенов Gerbich, встречаются среди жителей Папуа – Новой Гвинеи.

Многие Gerbich-отрицательные лица выявлены в связи с присутствием в сы-

воротке их крови антител Gerbich (Anstee и соавт. [5], Barnes, Lewis [6], Daniels

786

Рис.20.6.ЛокализацияэпитоповGe2–4нагликофоринеС

иD (по Daniels [24]).

исоавт. [29, 3], McLouglin, Rogers [66], Muller и соавт. [74], Nunn и соавт. [78], Okubo и соавт. [81], Peddle и соавт. [87], Reid и соавт. [91, 98], Rosenfield и соавт. [106], Rountree и соавт. [107], Sacks и соавт. [108]).

Фенотип Yus (Ge: −2, 3, 4) встречается реже, чем Ge: −2, −3, но такое соотношение может отражать лишь неодинаковую способность лиц с указанным фенотипом к антителообразованию (Daniels [25], Reid и соавт. [91]).

Лица Ge: −2, 3, 4 были обнаружены среди арабов, турок-киприотов и евреев, а также у негров.

Исследования посредством SDS-PAGE и иммуноблоттинга с МКА показано, что эритроциты Ge: −2,3,4 не содержат гликофорины С и D. Однако они несут гликофорин-С-подобную структуру с мол. массой 32,5–36,5 кДа, промежуточную между гликофоринами С и D (Anstee и соавт. [5], Dahr и соавт. [23], Reid

исоавт. [94]). В эритроцитах гетерозигот GYPC / GYPC.Yus гликофорины С и D присутствуют (Reid и соавт. [102]).

Анализ геномной и кодирующей ДНК показал, что лица Ge: −2,3,4 гомозиготны по гену GYPC.Yus, в котором экзон 2 подвергся делеции (Chang и соавт. [13], High и соавт. [39], Johnson, Daniels [44]). Продуктом указанного гена яв-

ляется гликофорин-С-подобный протеин без аминокислот в позициях 17–35, экспрессия антигенов Ge3 и Ge4 при этом сохранена. Вторая стартовая точка трансляции (Met 22) отсутствует, поэтому не происходит синтеза гликофорина D, несущего антиген Ge2.

787

Фенотип Ge: −2, 3, 4 может быть также результатом гетерозиготности по

GYPC.Yus / GYPC.Ge (Loirat и соавт. [58], Moulds и соавт. [72]). У 5 из 10 лиц

Ge: −2, 3 определялись оба типа гликофоринов –Yus и Ge (Moulds и соавт. [72]). Фенотип Ge: −2, −3,4 является типичным Gerbich-отрицательным. Он оказался полиморфным в некоторых районах Папуа – Новой Гвинеи (Booth, McLouglin и соавт. [11]). В других географических зонах земного шара фенотип Ge: −2, −3 встречается крайне редко, лишь в единичных случаях он был найден у европеоидов и негроидов, а также у монголоидов (японцев) и австралоидов (полинезийцев). Посемейные исследования показали, что гены, обусловливающие фенотип Ge: −2, −3, передаются по наследству (Nunn и соавт. [78], Okubo и соавт. [81],

Reid и соавт. [100, 102], Rosenfield и соавт. [106]).

Подобно эритроцитам Ge: −2,3,4, эритроциты Ge: −2, −3 не содержат гликофорины С и D, однако несут гликофорин-С-подобную структуру GPC.Ge с мол. массой 30,5–34,5 кДа, несколько меньшей по сравненю с мол. массой GPC.Yus. По электрофоретической подвижности вещество GPC.Ge занимает промежуточное положение между гликофоринами С и D (Anstee и соавт. [5], Dahr и соавт. [23], Reid и соавт. [94]). Гликофорин Gerbich-типа (GPC.Ge) содержит антиген Ge4, антиген Ge3 в нем отсутствует (Anstee и соавт. [5], Reid и соавт. [94]). В отличие от гликофоринов С, D и GPC.Yus, GPC.Ge устойчив к действию трипсина (Anstee и соавт. [5]). Моноклональные антитела к GPC.Ge (анти-Ge4) агглютинируют эритроциты Ge: −2, −3, 4, обработанные трипсином. Они также агглютинируют эритроциты лиц, гетерозиготных по гену Ge –2,–3,4.

Фенотип Ge: −2, −3, 4 возникает в результате делеции экзона 3 GPC (Colin и

соавт. [18], Chang и соавт. [13], High и соавт. [39], Loirat и соавт. [58], Serjeantson

788

исоавт. [110]). Аллель GPC.Ge кодирует гликофорин-С-подобную структуру, лишенную аминокислот в положениях 36–63. GPC.Ge несколько меньше гликофорина GPC.Yus, поскольку экзон 2 лишен вставки из 27 нуклеотидов, присутствующей в экзоне 3.

Еще один Gerbich-отрицательный фенотип, Ge: −2, −3, −4, получил обозначение Leach. Он является истинно нулевым фенотипом: эритроциты лиц с указанной редкой группой крови лишены всех антигенов системы Gerbich. В литературе имеются описания шести лиц Ge: −2, −3, −4. Все они оказались европеоида-

ми (англичане, американцы) (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], McShane, Chung [67], Reid и соавт. [98], Rountree и соавт. [107]).

Вдвух семьях удалось показать наследование рецессивных генов, обусловливающих возникновение фенотипа Ge: −2, −3, −4 (Daniels и соавт. [30], Reid и соавт. [98]). На эритроцитах лиц с этой крайне редкой группой крови гликофорины С и D полностью отсутствуют (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], High и соавт. [39], Reid и соавт. [94, 98]).

Фенотип Leach (Ge: −2, −3, −4) может быть обусловлен разными причинами. У 5 не состоящих в родстве лиц, выявлена делеция экзона 3 и 4 гена GYPC

(High и соавт. [39], Johnson, Daniels [44], Telen и соавт. [121], Winardi и соавт. [129]). В то же время из ретикулоцитов лиц Ge: −2, −3, −4 были выделены обычные транскрипты гена GYPC (Winardi и соавт. [129]).

У другого индивида Ge: −2, −3, −4 выделен полноценный ген GYPC, однако при секвенировании экзона 3 отмечена мутация, образующая стоп-кодон в позиции 56 (Telen и соавт. [121]). При этом не транслировалась большая часть экзона 3 и весь экзон 4. Тем не менее у обследуемых был выявлен небольшой фрагмент с мол. массой 12 кДа, напоминавший терминальную часть гликофоринов С и D (Pinder и соавт. [88]). В связи с этим высказано предположение, что трансляция дефектного гена GYPC может начинаться в других точках.

Имеется несколько сообщений о низкой экспрессии на эритроцитах Ge: −2, −3 антигенов Kell. Степень подавления у индивидов Ge: −2, −3 варьиро-

вала (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [25, 30], McShane, Chung [67], Nash

исоавт. [77], Okubo и соавт. [81]). Снижение экспрессии отмечено в отношении часто встречающихся антигенов Kell, в также антигена KEL1. У одного индивида отмечена слабая экспрессия антигена KEL11 (Daniels [25]), выраженность других антигенов соответствовала норме. В 9 из 11 образцов эритроцитов Ge: −2, −3 отмечена слабая выраженность антигенов Kell. В то же время шесть образцов эритроцитов Ge: −2, 3 имели нормальную экспрессию этих антигенов.

У 4 лиц Ge: −2, −3, −4 экспрессия антигенов Kell была слабой (Anstee и соавт. [5], Daniels и соавт. [30], McShane, Chung [67]).

Фенотипическая зависимость антигенов Kell от системы Gerbich реализуется, по-видимому, не на генетическом уровне, поскольку гены, контролирующие синтез вещества Gerbich и вещества Kell, расположены на разных хромосомах и непосредственное влияние их друг на друга исключено.

789

Редко встречающиеся антигены Gerbich

К системе Gerbich отнесены 4 редких антигена: Wb, Ls a,An a и Dh a, получившие обозначения GE5, GE6, GE7 и GE8. Они были включены в систему Gerbich в основном по результатам биохимических исследований, в которых было установлено место их расположения на гликофоринах С и D.

В эритроцитах обладателей редких антигенов Gerbich наряду с атипичными гликофоринами, несущими указанные редкие антигены, содержатся нормальные гликофорины С и D. Индивиды, гомозиготные по редким антигенам, не выявлены.

Wb

АнтигенWb (Webb) описали Simmons иAlbrey [112] в 1963 г. Антитела антиWb присутствовали в одной из сывороток для определения группы крови АВО. Три образца анти-Wb-антител обнаружено при проведении скрининга 7544 сы-

вороток (Bloomfield и соавт. [9], Race, Sanger [90]).

На эритроцитах Wb + гликофорин С частично замещен атипичным гликофорином (GPC.Wb), имеющим более низкую мол. массу (на 3 кДа ниже, чем гли-

кофорин С) (Macdonald, Gerns [60], Reid и соавт. [101]).

В этироцитах лиц Wb − указанный атипичный гликофорин отсутствует. Однако обработка эритроцитов Wb − эндогликозилазой F, которая отщепляет N-связанные олигосахариды, приводила к уменьшению мол. массы гликофорина С до значений, соответствующих таковым у GPC.Wb. Обработка эндогликозилазой F гликофорина GPC.Wb не оказывала на него влияния.

Улиц Wb + выявлена мутацияA23 G в экзоне 1 гена GYPC, ведущая к замещению аспарагиновой кислоты серином в позиции 8 молекулы гликофорина С

(Chang и соавт. [13], Telen и соавт. [122]).

Улиц Wb − аспарагиновая кислота в положении 8 N-гликозилирована, что обусловливает большую мол. массу нормального гликофорина С по сравнению с атипичным гликофорином GPC.Wb, который в этой точке не N-гликозилирован. Неизвестно, подвергается ли аспарагиновая кислота в положении 8 О-гликозилированию, что, возможно, могло бы привести к появлению нового редкого антигенного эпитопа Gerbich.

Антиген Wb разрушается трипсином и сиалидазой, но устойчив к химотрип-

сину (Macdonald, Gerns [60], Reid и соавт. [95,101]).

Lsa

Антигены Ls a (Lewis II) и Rl a при сравнении оказались одним и тем же антигеном (Kornstad и соавт. [50, 51]). Он выявляется у финнов и негров с частотой около 2 %, у других народов он встречается реже (табл. 20.5).

Анти-Ls a-антитела впервые выявлены в анти-В-реагенте для определения группы крови АВО. Другие образцы идентифицированы в сыворотках с комбинированными антителами (Kornstad [50]), а также при выполнении проб на

790