Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии

проназойилихимотрипсином,приэлектрофорезевполиакриламидномгеле(SDSPAGE) оказался неоднородным (Mueller, Morrison [123]). В большинстве образцов присутствовали фракции с мол. массой 60 кДа, представляющие N-терминальный регион,инебольшоеколичествокомпонентовсмол.массой63кДа.

Один из вариантов протеина полосы 3, названный Мемфис, обусловлен точковой мутацией в паре нуклеотидов внутри экзона 4, которая приводит к замещению лизина на глютаминовую кислоту в цитоплазматическом N-терминальном домене белка полосы 3 (Yannoukakos и соавт. [176], Jarolim и соавт. [76]). У некоторых индивидов, гомозиготных по указанному мутантному гену, присутствовал только протеин с мол. массой 63 кДа (Ranney и соавт. [138], Ideguchi и соавт. [62]). Вариант Мемфис протеина полосы 3 был обнаружен у 6–7 % произвольно взятых доноров. Его частота оказалась выше среди американских негров (16 %), индейцев (17–25 %), китайцев (13 %), жителей Филиппин (17 %) и японцев (29 %) (Yannoukakos и соавт. [176], Jarolim и со-

авт. [76]). Ингибиторы эритроцитарного транспортера анионов диизотиоцианатстилбен (DIDS) и его дигидрат (H160mIDS) ковалентно связывались с лизином в позиции 539 белка полосы 3 (Tanner и соавт. [160]). У некоторых индивидов с Мемфис-вариантом белка полосы 3 отмечено повышенное связывание H160mIDS (Hsu, Morrison [60]). Такой тип белка полосы 3 был обозначен как Мемфисвариант II для дифференцировки с Мемфис-вариантом I, которому свойствен нормальный уровень связывания H160mIDS.

Spring et al [157] указали на ассоциацию между фенотипами системы Diegо и вариантами протеина полосы 3 при исследовании в SDS-PAGE. Они установили, что наличие Мемфис-варианта II всегда было ассоциировано с наличием на эритроцитах антигена Di a. Белок полосы 3 таких эритроцитов связывал в 3 раза больше H160mIDS с радиоактивной меткой, а клетки Di(a −) проявляли нормальный уровень связывания H160mIDS. Таким образом, эпитопы Di a ассоциированы с протеином полосы 3 Мемфис-варианта II, а другие варианты этого белка (Мемфис-вариант I и обычный) – с антигенными эпитопами Di b.

Bruce и соавт. [16], проведя амплификацию кодирующего региона белка полосы 3 для выделения кДНК, сумели доказать, что экспрессия антигена Di a и Мемфис-варианта II ассоциированы с заменой С 2561 Т в экзоне 19: ген Di a кодирует лейцин в позиции 854, а в присутствии Di b это положение занимает пролин. Кроме того, внутри гена Di a отсутствуют сайты рестрикции MspI и NaeI. В соответствии с моделью, в которой трансмембранная часть протеина полосы 3 представлена 14 доменами, аминокислотные замены имеются в 7 экстрацеллюлярных петлях белка (рис. 12.2). Повышенное связывание H160mIDS происходит в связи с локальными пространственными изменениями, влияющими на перекрестные связи между лизином в положении 851 на седьмой петле и той же аминокислотой в положении 539 в трансмембранном домене (Salhany и соавт. [150]).

При исследовании генотипа с помощью ПЦР у 72 бразильских индейцев племени Паракана из Амазонии выявлено 26 индивидов Di a / Di a, 26 – Di a / Di b

661

Рис. 12.2. Локализация антигенных эпитопов Diegо на эритроците и топология протеина полосы 3.

и 19 – Di b / Di b. Таким образом, в этой этнической группе гены Di a и Di b имели частоту 0,56 и 0,44 соответственно (Castilho и соавт. [24]). Анализ вариантов Мемфис белка полосы 3 с рестрикцией MspI подтвердил корреляцию аллелей Di a и Di b с кодонами Glu 56 и Lys 56 соответственно. Исключение составили индивиды Di a / Di a, гетерозиготные по Glu 56 и Lys 56 кодонам.

Jarolim и соавт. [74] описали 2 европеоидов Di(a +b −), гетерозиготность которых (Di a / Di b) подтверждалась молекулярно-генетическими тестами. У одного из них выявлена мутация, изменявшая рамку считывания, у другого – нонсенскодон внутри Di b.

Антигены Di a и Di b устойчивы к действию папаина, трипсина, α-химотрипсина, проназы,сиалидазыисульфгидрильнымредуцентам(Daniels[36]).

Иногда антиген Di b может быть слабо выражен. Описана мексиканская женщина, фенотип которой при первичном исследовании был определен как Di(a −b −). Однако последующие исследования выявили у нее слабый антиген Di b (Biro и соавт. [14]). Низкий уровень экспрессии антигена Di b у нескольких мексиканцев с фенотипом Di(a + ) описали Edwards-Moulds, Alperin [42]). При обследовании 784 жителей Америки испанского происхождения Issitt и соавт. [70] установили, что все они имеют антиген Di b, в 11 случаях последний был слабо выражен. Исследование этих образцов с сыворотками анти-Di a лишь в одном случае выявило этот антиген. Таким образом, феномен слабой экспрессии антигена Di b не был связан с эффектом дозы. Сниженная экспрессия антигена Di b имелась у лиц с овалоцитозом, встречающимся в Юго-Восточной Азии

(Kusnierz-Alejska, Bochenek [89]).

662

Протеин полосы 3

Белок полосы 3, отвечающий за транспорт анионов (АЕ1, или CD233), входит в структуру гликопротеинов эритроцитарной мембраны. Каждый эритроцит содержит примерно 1,2 млн молекул этого белка, который легко выявляют электрофорезом в полиакриламидном геле после обработки субстрата додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE). Он мигрирует в область структур, име-

ющих мол. массу 100 кДа (Bruce, Tanner [18], Tanner [158, 159]).

Ген SLC4A1, контролирующий синтез белка полосы 3, имеет величину 18 кб и включает 20 экзонов (Schofield и соавт. [151]). Клонирование и секвенирование геномной ДНК белка полосы 3 подтвердило, что эта структура состоит из 3 доменов. Цитоплазматический N-терминальный домен состоит из 403 аминокислот, гидрофобный трансмембранный домен представлен 479 аминокислотами, С-терминальный – 29 (см. рис. 12.2, 12.3) (Tanner

исоавт. [160], Lux и соавт. [112]). Терминальный N-домен взаимодействует с анкирином цитоскелетона. Трансмембранная часть белка полосы 3 в эритроците включает 14 доменов, экстрацеллюлярная часть представлена 7 петлями (см. рис. 12.2). Участок, связанный с олигосахаридами в области Asn 642 на четвертой экстрацеллюлярной петле, обладает серологической активностью в отношении антител анти-H, анти-A, анти-B, анти-I и анти-i. Количественные вариации протеина полосы 3 подсчитаны по числу повторяющихся N-ацетил- лактозаминовых группировок. Белок полосы 3 в мембране эритроцитов представлен олигомерами (ди-, три-, тетра- и т. д.) (Popov и соавт. [136], Fujinaga

исоавт. [46]). Тетрамеры преимущественно связаны с анкирином (Van Dort и

соавт. [167], Zafar, Reid [180]).

Рис.12.3.Аминокислотнаяпоследовательностьпротеинаполосы3эритроцитовчеловека.

663

Ассоциация антигенов Diegо с протеином полосы 3 и гликофорином А

Протеин полосы 3 тесно связан в мембране эритроцитов с гликофорином А. Антитела к протеину полосы 3 преципитировали как этот белок, так и гликофорин А (Wainwright и соавт. [169], Tanner [160]). Антитела против гликофорина А существенно снижали подвижность протеина полосы 3 (Nigg и соавт. [125], Che, Sherry [26], Paulitschke и соавт. [130]).

ПомнениюGroves,Tanner[53]гликофоринАспособствуетпереносувновьобразовавшихся молекул белка полосы 3 в мембрану эритроцитов. Однако гликофорин А не является строго обязательной структурой, необходимой для экспрессии белка полосы 3, хотя при его дефиците протеин полосы 3 медленнее движется к мембране и его прикрепление к ней остается незавершенным. В эритроцитах, дефицитных по гликофорину А, протеин полосы 3 имеет более высокую мол. массу и, несмотря на его нормальное количественное содержание, транспорт анионов через мембрану таких эритроцитов затруднен. Эритроциты мышей, у которых направленно был инактивирован ген белка полосы 3 (нокаутные мыши), имели низкое содержание как протеина полосы 3, так и гликофорина А, что дало основание полагать, что белок полосы 3 важен для формирования гликофорина А на мембране эритроцитов (Hassoun и соавт. [57]). Однако эти экспериментальные данные вряд ли можно экстраполировать на человека, поскольку у человека в процессе гемопоэза гликофорин появляется на мембране эритроцитов раньше белка полосы 3 (Southscott и соавт. [156], Daniels, Green [38]). В то же время эритролей-

кемическая линия клеток человека K562 экспрессирует гликофорин А, а протеин полосы 3 не экспрессирует (Gahmberg,Andersson [48], Beckman и соавт. [11]).

Ribeiro и соавт. [142] описали ребенка с полным отсутствием белка полосы 3, однако его эритроциты при этом содержали, хотя и в небольшом количестве, гликофорин А.

Эритроциты трансгенных мышей экспрессировали гликофорин А человека, но в то же время содержание в них мышиного гликофорина А было снижено. Это указывает на возможную конкуренцию двух разных в видовом отношении гликофоринов, участвующих в формировании белка полосы 3 (Auffray и соавт. [10]).

Антиген Wr b не экспрессируется в отсутствие гликофорина А. Эритроциты с дефицитом гликофорина А имеют фенотип En(a −) по системе MN и Wr(a −b −) по системе Diegо (Issitt и соавт. [68, 69]). Образцы эритроцитов Wr(a −b −), которые содержали некоторое количество гибридных гликофоринов, реагировали с антителами анти-En a. Эритроциты индивидов Wr(a +b −) имели нормальную экспрессию антигенов M, N, S, s и En a (Dahr и соавт. [35]). Секвенирование гена GYPA у лицWr(a +b −) не выявило каких-либо особенностей (Bruce и соавт. [17]).

Большинство моноклональных антител к гликофорину А преципитировало указанный гликофорин, но не преципитировало белк полосы 3. Преципитация гликофорина А происходила с анти-Wr b-антителами (Ridgwell и соавт. [144, 145]), которые одновременно преципитировали и протеин полосы 3 (Telen,

664

Chasis [163], Ring и соавт. [147]), обнаруживая тем самым структурное сходство обоих антигенных субстратов. Шесть образцов сывороток с аутоантителами также вызывали преципитацию протеина полосы 3 и гликофорина А (Leddy

исоавт. [97]). Антитела анти-Wr b содержались лишь в 3 из 6 упомянутых сывороток с аутоантителами, и это свидетельствует о том, что могут существовать другие антигенные эпитопы, общие для протеина полосы 3 и гликофорина А.

Гемагглютинирующую активность аллоиммунных антител анти-Wr b оказалось возможнымингибироватьочищеннымифрагментамигликофоринаА,ноингибирующаяактивностьбыланизкойиееможнобыловыявитьлишьвприсутствиилипидов(Dahrисоавт.[35]).АктивностьодногообразцамоноклональныхантителантиWr b угнеталась синтетическим пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, свойственную гликофорину А в положениях 56–70. Этот синтетический пептид не снижал активность аллоиммунных, аутоиммунных, а также двух образцов моноклональных антител анти-Wr b (Rearden [139]). Моноклональные антитела не связывались с клеточными линиями человека, не экспрессирующими гликофорин А и белок полосы 3 (Telen, Chasis [163]). Клеточная линия K562 экспрессируетгликофоринАбезпротеинаполосы3иантигенаWr b,однакотрансфекцияклеток кДНК белка полосы 3 индуцировала экспрессию антигена Wr b (Beckman и соавт. [11]). В экспериментах с искусственным эритропоэзом in vitro белок полосы 3

иантиген Wr b появлялись на клетках в одно время, после гликофорина А (Daniels, Green [38]). Связывание антител с экстрацеллюлярным доменом гликофорина А вызывало одновременно иммобилизацию протеина 3, этот эффект был заметно сниженприиспользованииэритроцитовWr(a +b −)(Paulitschkeисоавт.[130]).

Bruce и соавт. [17], Huang и соавт. [61], Poole [132] сравнили аминокислотную последовательность гликофорина А, гибридного гликофорина GP(B-A)Sch., ассоциированного с антигеном Wr b, а также гибридов GP(A-B)Hil и GP(B-A)Dantu, ассоциированных с фенотипомWr(a −b −). Результаты позволили заключить, что аминокислоты в позициях 55–68 α-спирального региона, близкого к месту встраивания гликофорина А в мембрану эритроцитов, могут играть важную роль в экспрессии антигена Wr b. Аминокислотные замены Gln 63 Lys и Ala 65 Pro ассоциированы с необычно высокой экспрессией антигена Wr b. На эритроцитах с гибридными гликофоринами, экспрессирующими антиген SAT, фактор Wr b отсутствовал, несмотря наналичиеаминокислот,происходящихизучастков1–70или1–71гликофоринаА. Вероятно, что взаимодействие протеина полосы 3 и гликофорина А происходит через трансмембранный домен гликофорина А и восьмой трансмембранный домен белка полосы 3, а также через экстрацеллюлярные участки, находящиеся рядом с этимитрансмембраннымидоменами.

Таким образом, связь гликофорина А и протеина полосы 3 очевидна. Эритроциты En(a −) M kM k не содержат гликофорина А и являются Wr(a −b −). Антиген Wr b отсутствует на эритроцитах, несущих гибридные гликофорины

GP.Hil, GP.TSEN, GP.SAT, GP.TK или GP.Dantu. Во всех случаях в позиции 658

протеина полосы 3 присутствует глютаминовая кислота, однако для экспрессии

665

антигена Wr b еще необходимы соответствующие аминокислоты в составе указанных гликофоринов. ЭкспрессияWr b ослаблена на эритроцитах с гибридными гликофоринами GP.HAG и GP.MARS, которые несут фрагменты гликофорина А с заменами аминокислот Gln 63 Lys иAla 65 Pro соответственно (см. Система MNS).

Остается невыясненным, требуется ли присутствие самого гликофорина А для экспрессии антигена Wr a. Попытки исследовать компоненты эритроцитарной мембраны иммунопреципитацией моноклональными антителами анти-Wr a успеха не принесли (Ring и соавт. [147]).

Редкие антигены системы Diegо

На протяжении почти 30 лет (с 1967 по 1995 г.) систему Diegо считали простой диаллельной системой, состоящей из двух антитетичных антигенов Di a и Di b. Как упоминалось выше, антигены Wr a и Wr b были сначала выделены в коллекцию Райт (Wright) и лишь после 1995 г. вошли в систему Diegо. Далее эта система пополнилась большим числом других редко встречающихся специфичностей (табл. 12.5). Многие из них были открыты ранее, но не были отнесены к системе Diegо или какой-либо другой известной эритроцитарной групповой системе. Положение изменилось с середины 1990-х годов благодаря успехам молекулярной генетики. Многие носители редких антигенов по результатам молекулярно-генетических исследований имели точковые мутации гена АЕ1, кодирующего протеин полосы 3 (Orita

и соавт. [128], Poole и соавт. [134], Zelinski и соавт. [182–184], McManus и соавт. [114, 115], Jarolim и соавт. [71–73, 75], Bruce и соавт. [20], Poole и соавт. [135]). Обследование неродственных лиц, имевших однотипные редкие антигены, позволило установить идентичность мутаций, приводящих к экспрессии этих антигенов. Одинаковые мутации выявлены у родственников, членов одних и тех же семей – носителей редких антигенов Diegо: WARR (Di7) (Jarolim и соавт. [71]), Vg a (Di13) (Jarolim и соавт. [75]), KREP (Di18) (Poole и

соавт. [134]). Исключение представляет антиген Tr a (Traversu); определяющая его мутация выявлена у одного индивида Tr(a + ) (Jarolim и соавт. [72]).

Присутствие редких антигенов Diegо обусловлено, как правило, одной аминокислотной заменой (табл. 12.1, 12.6). Исключение представляют антигены NFLD (Di16) (2 аминокислотные замены) и Sw a (в одной позиции 2 альтернативные аминокислоты). Мутации располагаются исключительно в экстрацеллюлярных доменах белка полосы 3. Исключение составляет лишь антиген Bp a (Di10), характеризующийся аминокислотной заменой, расположенной в трансмембранном домене, в непосредственной близости к экстрацеллюлярной петле 3 (Jarolim и соавт. [75]). Антитела анти-Bp a, таким образом, распознают лишь участок экстрацеллюлярной петли 3 протеина полосы 3. Чаще аминокислотные замены происходят в экстрацеллюлярных петлях 3 и 4, однако с антигенами ELO (Di8) и NFLD (Di16) они имели место в петле 1; с антигеном Fr a (Di20) – в трансмембранном домене вблизи петли 2. Антигенный полиморфизм Di a / Di b

666

обусловлен аминокислотной заменой в седьмой экстрацеллюлярной петле белка полосы 3 (см. рис. 12.2).

Единичные аминокислотные замены не сказываются на способности протеина полосы 3 обеспечивать транспорт анионов. Не исключено также, что экстрацеллюлярные домены 3 и 4 с мутациями, определяющими редкие антигены Diegо, не имеют непосредственного отношения к транспорту анионов

(Jarolim и соавт. [75]).

Характер аминокислотных замен позволяет полагать, что они возникли сравнительно недавно в процессе эволюции и, таким образом, ген SLC4A1 не относится к консервативным. В этом отношении исключением являются замены

667

аминокислот на лизин, ассоциированные с присутствием редкого антигена Bp a (Di10, Bishop). Эти замены в протеине полосы 3, по мнению Jarolim и соавт. [75], не имеют непосредственного отношения к транспорту анионов.

Примечание. у – устойчивы, ну – не устойчивы, в – устойчивость варьирует.

Экспрессия антигенов BOW и NFLD ассоциирована с заменами пролина в позиции 561 на другие аминокислоты, а антиген Wu экспрессируется в том случае, если в положении 565 произошла замена глицина (Poole и соавт. [134], Jarolim и соавт. [75], McManus и соавт. [115], Zelinski и соавт. [182]).

668

Экспрессия антигена NFLD ассоциирована с аминокислотными заменами в первой и третьей экстрацеллюлярных петлях протеина полосы 3 (McManus

исоавт. [115]). Некоторые образцы, несущие антиген Sw a, содержат также и фактор SW1, в то время как другие образцы Sw(a + ) являются SW1отрицательными (Contreras и соавт. [33], Zelinski и соавт. [184]). Антитела анти-Sw a распознают участки, в которых аргинин в положении 646 заменен глютаминовой кислотой или триптофаном, а анти-SW1-антитела реагируют только с субстратом, обусловленным заменой Arg 646 Trp (Zelinski и соавт. [184]). Появление редких антигенов Hg a (Di12) и Mo a(Di11) также вызвано заменой аргинина в позиции 646.

Антигены системы Diegо в основном устойчивы к воздействию протеолитических ферментов (см. табл. 12.6). Протеин полосы 3 имеет 2 участка, расщепляемых химотрипсином, на третьей экстрацеллюлярной петле в позициях 553 и 555, занимаемых тирозином. Антигенные эпитопы Diegо, расположенные вблизи этих участков, чувствительны к действию α-химотрипсина. Антигенные эпитопы, расположенные на других участках, в частности на четвертой и седьмой петлях, напротив, устойчивы к действию протеолитических ферментов.

Антитела к редким антигенам системы Diegо не вызывают посттрансфузионных осложнений и ГБН. Имеется лишь одно упоминание о посттрансфузионной реакции, связанной с антителами анти-ELO. Другой из описанных образцов антител системы Diegо (анти-Fr a) обусловил лишь положительную прямую антиглобулиновую пробу с эритроцитами новорожденного без каких-либо клинических проявлений (Harris и соавт. [56]).

Некоторые сыворотки содержат полиспецифические антитела, реагирующие со многими редкими антигенами, в том числе системы Diegо. Нередко указанные антитела наблюдали в отсутствие антигенных стимуляций беременностями

игемотрансфузиями.

Ford и соавт. [45] и Harris и соавт. [56] получили антитела анти-ELO, антиSw a и анти-Fr a искусственной иммунизацией добровольцев эритроцитами, содержащими указанные антигены.

Wda (Waldner)

Первое сообщение об антигене Wd a появилось в 1983 г. в результате обследования доноров сывороткой анти-Fr a (Di20). Указанная сыворотка реагировала с эритроцитами некоторых членов семьи Waldner. Однако далее выяснилось, что антиген, выявленный в этой семье, не идентичен Fr a, в связи с чем он был обозначен как Wd a и, так же как другие редкие антигены, отнесен в серию 700, под номером 700.030. В систему Diegо он был включен в 1996 г.

Антиген Wd a найден только в 3 семьях (Moores и соавт. [120]). Он полностью развит на эритроцитах к моменту рождения. Вещество Wd a устойчиво к действию протеолитических ферментов, за исключением α-химотрипсина.

669

Антитела анти-Wd a не найдены ни у 1 из 6 женщин Wd(a −), родивших, по наблюдениямLewisиKaita[101],30 детейWd(a + ).Втойжепубликацииавторысообщили о выявлении антител анти-Wd a у 1 из 358 обследованных беременных.

Антитела анти-Wd a обнаружены в полиспецифических сыворотках с антителами против других редко встречающихся антигенов.

Rba (Redelberger)

История антигена Rb a, открытого Lang и соавт. [90] в 1978 г., весьма необычна. Он получил обозначение по фамилии мистера Редельбергера, активного пропагандиста донорства, который сам неоднократно давал кровь. Эритроциты мистера Редельбергера, пятикратно типированные как резус-отрицательные, после очередной донации в 1974 г. дали положительную реакцию с реагентом антиCDE производства фирмы «Gamma Biologicals Inc.», в то время как реагенты анти-CDE других производителей с эритроцитами не реагировали. Сыворотку анти-Е, использованную как компонент анти-CDE-реагента, и эритроциты мистера Редельбергера направили в несколько лабораторий для уточнения специфичности. Сначала полагали, что редкий антиген, выявленный на эритроцитах одним из анти-CDE-реагентов, является Bp a (Bishop), однако дальнейшие исследования показали, что он не идентичен Bp a.

Сам мистер Ричард Редельбергер был неудовлетворен тем, что новый антиген, обнаруженный на его эритроцитах называется «Bishop», что в переводе означает «антигенепископа».Всвязисэтимантигенпереименовали,ион,получиввчесть мистера Редельбергера свое нынешнее обозначение – Rb a, был включен в серию 700 под номером 700027, а в 1996 г. – в систему Diegо под номером 6.

Обнаружение носителя антигена Rb a в США также было связано с некоторым курьезом. Эритроциты донора RT, фенотипированные как OccDEE, были включены в коммерческий набор для скрининга антиэритроцитарных антител. После реализации набора фирма получила жалобы из нескольких лабораторий. Их суть заключалась в том, что у многих больных выявлены антитела к указанному образцу эритроцитов. Этого не наблюдалось с эритроцитами OccDEE из других наборов. В одном из госпиталей найдено 7 положительно реагировавших сывороток, хотя 4 из 7 больных не получали гемотрансфузий. Из другого госпиталя сообщили, что антитела к эритроцитам RT найдены у 5 из 6 обследованных.

Детальное исследование эритроцитов донора RT показало наличие в них антигена Rb a.

Позднее носители антигена Rb a были найдены в одной американской семье, члены которой, как выяснилось, являлись родственниками мистера Редельбергера и, так же как он, были активными донорами. Его внучатая племянница сообщила, что дала костный мозг для трансплантации. При обследовании реципиента установлено, что его фенотип после пересадки костного мозга изменился с Rb(a −) на Rb(a + ) (Lang и соавт. [90]).

670