Репликация днк. Особенности репликации у эукариот. Теломеры и теломеразы, их био значение.

Репликация(самоудвоен ДНК) инициация, элонгац, терминац.

Протекает во время S-периода интерфазы. В результате реплик хромосомы станов 2хроматидные. Реплик протекает полуконсервативным образом (это значит что в каждой из дочерних молекул ДНК одна цепь отстает от материнской, 2-я полинуклеотидная цепь синтезир-ется заново. Такой способ обеспечивает максимальную точность распределения наследственной инф. В молекуле ДНК сущ регуляторные участки обозначающие начало репликации (они называются точки Ori) В этом месте ферменты раскручивают молекулу ДНК разрывают водород связи между комплементарными основаниями. При этом формируется глазок репликации.

У покариот в кольцевой молекуле ДНК 1 точка ори. У эукариот множество. Собственное построение дочерних ДНК происходит в вилках репликации. От каждого глазка реплик в противоположном направлен идут 2е вилки репликации. Встреча 2х вилок это сигнал для терминации (окончан процесса).

Вилка репликации

1) геликаза внедряется между цепями ДНК разрывает водород связи. Впереди вилки репликации образ зона сверхспирализации.

2) фермент толоизомераза снимает сверхспирализацию за счет того что делает точные надрезы в одной из цепей ДНК.

3) SSB-белки (дестабилизирующие белки) связывают с одноцепочечной ДНК препятствуя восстановлению водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями.

Свойство ДНК полимеразы 3

1) подбирают нуклеотиды по принцеп комплементарн выстраивая дочерн цепь ДНК.

2) не умеет став 1й нуклеотид. Для начал работы ей нужн свобод ОН группа. Вспомогат фермент праймаза стройт РНК затравку (праймер) со свобод ОН группой на конце.

3) мономеры для синтеза поступ в виде нуклеозид 3 фосфата. Очередной нуклеотид присоед за счет отщеплен 2х остатков фосфор к-ты.4) построен дочерн цепи мож идти тольк в направлен от 5/ к 3/ концу.

5) ДНК полимераза облад экзонуклеазной активностью. Она способн заменить последн неправ поставлн нуклеотид.

На одной из цепей ДНК построен идет непрерывн от 1го праймера (мидирующ цепь). На 2й цепи построен идет идёт участками по мере раскруч материнск ДНК. Для кажд участка строится свой праймер.кажд из этих участков наз фрагмент оказаки, а цепь отстающ.

6) фермент ДНК полимераза1 занимает рибонуклеотиды праймеров на дезоксирибонукл.

7) ДНК-лигаза сшив межд собой фрагменты оказаки

19. Транскрипция. Характеристика этапов инициации, элонгации и терминации. Особенности транскрипции у про- и эукариот.

Транскрипция – синтез всех видов РНК на матрице ДНК. Транскрибируемый участок ДНК – наз ген. (транскрипция – процесс перевода ген инф в виде последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК в последовательности нуклеотидов в молекуле иРНК. )

Ген - (от греч. genos - род, происхождение) - основная структурная и функциональная единица наследственности, определяющая развитие данного признака. Структурный ген - это транскрибируемый участок ДНК (у некоторых вирусов - РНК), в котором закодирована информация о первичной структуре одной макромолекулы - полипептидной цепи, р-РНК или т-РНК. Регуляторные гены регулируют экспрессию других генов.

Гены делятся на структурные и функциональные. Для каждого вида РНК существует своя РНК-полимераза.

Синтез информационной РНК ведет РНК полимеразу 2.

Транскрипция происходит на протяжении всего периода интерфазы.

(1.) инициация – основной фермент транскрипции это РНК полимераза. различают 3 вида РНК: рнк полимераза 1-синтезирует ррнк. Рнк полимераза 2- синтезует ирнк. Рнк полимераза 3-синтез трнк.

Этапы:

1)цепи ДНК расплетаются причем сама рнк полимеризуется обладая геликазной активностью

2)рнк полимераза синтезирует короткий участок рнк 3) синтез идёт быстрее.

(2.) элонгация –синтез в направлении от5\ к 3\ по ирнк по принцепу комплементарности. Новые нуклеотиды поступают в форме нуклеозид 3 фосфатов. Энергия для присоединения нового нуклеотида выделяется при гидролизе 2х последних фосфатных групп.

(3.) терминация – в области терминатора особого участка ДНК происходит образ «шпилек» в молекуле РНК шпильки образ за счет внутрицепочечных водродных связей. Вновь синтезирируемая ДНК отщипляется от РНК.

Промотор-регулятор участок ДНК перед структурным геном который не транскрибируется.

Функции:

указывает точку начала синтеза; указывает смыслов цепь ДНК; инициирует РНК-полимеразу.

Промотор всегда содержит последовательность нуклеотидов ТАТА.

Транскрипция – синтез всех видов РНК на матрице ДНК. Транскрибируемый участок ДНК – наз ген. (транскрипция – процесс перевода ген инф в виде последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК в последовательности нуклеотидов в молекуле иРНК. )

Ген - (от греч. genos - род, происхождение) - основная структурная и функциональная единица наследственности, определяющая развитие данного признака.

1.) инициация – основной фермент транскрипции это РНК полимераза. различают 3 вида РНК: рнк полимераза 1-синтезирует ррнк. Рнк полимераза 2- синтезует ирнк. Рнк полимераза 3-синтез трнк.

Этапы: 1)цепи ДНК расплетаются причем сама рнк полимеризуется обладая геликазной активностью

2)рнк полимераза синтезирует короткий участок рнк 3) синтез идёт быстрее.

(2.) элонгация –синтез в направлении от5\ к 3\ по ирнк по принцепу комплементарности. Новые нуклеотиды поступают в форме нуклеозид 3 фосфатов. Энергия для присоединения нового нуклеотида выделяется при гидролизе 2х последних фосфатных групп.

(3.) терминация – в области терминатора особого участка ДНК происходит образ «шпилек» в молекуле РНК шпильки образ за счет внутрицепочечных водродных связей. Вновь синтезирируемая ДНК отщипляется от РНК. Промотор-регулятор участок ДНК перед структурным геном который не транскрибируется. Функции: указывает точку начала синтеза; указывает смыслов цепь ДНК; инициирует РНК-

20. Посттранскрипционный процессинг, его этапы. Строение зрелой м-РНК (схема расположения функциональных участков молекулы зрелой м-РНК).

Это совокупность процессов обеспечивающих превращение синтезированной РНК (РНК-транскрипта) в функционально активные РНК (зрелые РНК), которые могут быть использованы при синтезе белков. Сами РНК-транскрипты функционально не активные. Процесс характерен для эукариот.

В результате процессинга изменяется структура и химическая организация РНК. РНК-транскрипт до образования зрелой РНК носит название про-иРНК(или в зависимости от вида РНК – про-тРНК, про-рРНК), т.е. предшественница РНК. Практически все РНК-транскрипты эукариот и прокариот(за исключением иРНК прокариот)подвергаются процессингу. Превращение РНК-транскрипта в зрелую РНК начинается в ядре, когда синтез РНК ещё не закончен и она не отделилась от ДНК. В зависимости от механизмов различают несколько этапов созревания РНК.

1. Взаимодействие про-иРНК с белком.

2. Метилирование про-иРНК.

3. Кэпирование 5’-конца.

4. Полиаденилирование.

5. Сплайсинг .

Графическая последовательность этапов изображена на рисунке 58. Следует отметить, что в живых организмах все вышеперечисленные процессы идут параллельно друг другу.

а. Взаимодействие про-иРНК с белком.

У бактерий ещё до окончания транскрипции 5^’конец транскрипта сразу же соединяется с рибосомой и иРНК включается в трансляцию. Поэтому, для бактериальной иРНК практически никакая модификация не требуется. У эукариот, синтезированный транскрипт выходит из ядра, попадает в цитоплазму и там соединиться с рибосомой. На своём пути он должен быть ограждён от случайных встреч с сильными реагентами и, в тоже время быть, доступен ферментам процессинга. Поэтому РНК-транскрипт сразу же по мере удлинения взаимодействует с белком. Здесь уместна аналогия – РНК-транскрипт располагается на белке как на операционном столе, он фиксируется химическими связями, одновременно в нём становятся доступными места модификации. РНК, связанная с белком, носит название рибонуклеопротеид ( информосома). В такой форме транскрипт находится в ядре. При выходе из ядра одни РНК продолжают оставаться в соединении с белком, другие выходят из комплекса и принимают участие в трансляции.

б. Метилирование про-иРНК.

Чаще всего происходит у бактерий, у которых имеется специальный аппарат защиты от чужеродной

ДНК (вирусной, фаговой). Этот аппарат состоит из целого ряда ферментов разрезающих чужеродную ДНК или РНК в определённых сайтах в которой находится специфическая последовательность нуклеотидов. Ферменты носят название – рестриктазы. Понятно, что собственный, только что синтезированный РНК-транскрипт, также может быть подвергнут атаке рестриктаз. Чтобы это не случилось специальные ферменты, называемые метилазы,метилируют собственный РНК-транскрипт в тех сайтах, которые могут быть разрезаны собственными ферментами. У эукариот РНК-транскрипт метилируется в меньшей степени.

Промотор Терминатор

Транскрипция

Про-иРНК

Про-иРНК фикси- Белок

рванная на белке

Метилирование про-иРНК

Кэпирование про-иРНК

Полиаденилирование

Сплайсинг (см. далее)

Рис. 58. Схема основных моментов процессинга.

в. Кэпирование 5’конца.

Заключается в химическом и конформационном изменении

5’конца синтезированной РНК. Кэпирование происходит в момент синтеза РНК, ещё до её отделения. Процесс заключается в присоединении к свободному концу про-РНК специальных химических веществ, которые изменяют конформацию концевого участка. Кэпирование необходимо для инициации процесса трансляции.

Специальные ферменты присоединяют к 5’концу про-иРНК ГДФ (гуанозиндифосфат), а затем метилируют его.

ГДФ

5’ про-иРНК

СН₃

КЭП = ГДФ + СН₃

Рис.59. Структура КЭПа на 5’конце пре-иРНК эукариот.

Функции КЭПа.

1. Инициирует синтез белка.

2. Предохраняет про-иРНК от распада.

3. Участвует в удалении интронов.

г. Полиаденилирование.

Это процесс присоединения к 3’ концу про-иРНК 100 – 200 остатков адениловой кислоты. Эти остатки носят название поли-А последовательности (поли-А хвосты). Полиаденилированию подвергаются не все про-иРНК. Например, молекулы всех типов гистонов не содержат поли-А последовательности. Полиаденилирование предохраняет иРНК от разрушения.

На растущей цепи и-РНК имеется специальная последовательность нуклеотидов (ААУААА). Особый фермент ( полиА-полимераза) находит это сочетание нуклеотидов, разрезает про-иРНК в этом месте и формирует полиадениловый хвостик.

Значение поли –А последовательностей:

1. Облегчают выход иРНК из ядра в цитоплазму.

2. Предохраняют иРНК от разрушения.

Недавно было выявлено ещё одно интересное свойство поли-А последовательностей – они участвуют в терминации синтеза про-иРНК. РНК-полимераза, формируя последовательность ААУААА в про-иРНК, получает сигнал о завершении синтеза РНК-транскрипта. Но синтез сразу не прекращается. Полная остановка его наступает после того, как РНК-полимераза встречает на матричной нити ДНК специфическую последовательность нуклеотидов (у разных генов она разная), которая и даёт окончательный сигнал о прекращении синтеза РНК.

ГТФ ПолиА - последовательность

рАрАрАрАрАрАрАрА-ОН

СН₃

КЭП = ГТФ + СН₃

Рис. 60. Структура КЭПа на 5’конце про-иРНК эукариот и полиадениловая последовательность на 3’конце про -иРНК.

д. Сплайсинг.

В РНК-транскрипте содержится определённое количество нуклеотидных последовательностей, которые были необходимы для успешного завершения трансляции и последующей модификации транскрипта (кэпирования, полиаденилирования и т.д.). Для выполнения основной роли РНК в цитоплазме – трансляции, эти последовательности не только не будут иметь функционального значения, но могут помешать нормальному течению синтеза белка. Поэтому в клетке предусмотрен механизм освобождения первичного транскрипта от целого ряда последовательностей, не имеющих решающего значения в трансляции.

К таким последовательностям прежде всего относят интроны.

Ген, с которого транскрибировалась про-иРНК содержит кодирующие и некодирующие последовательности. Кодирующие последовательности гена определяют аминокислоту и их последовательность в белке. Не кодирующие последовательности таким свойством не обладают. Кодирующие и некодирующие последовательности в гене чередуются, и их количество зависит от индивидуальных генов. В первичном транскрипте также содержатся кодирующие и некодирующие последовательности. Такая организация генов и про-РНК характерна для эукариот. Некодирующие последовательности про-иРНК носят название интроны, а кодирующие –экзоны. Длина интронов может быть от 50 до 12000 нуклеотидов. Ген начинается и

кончается экзоном. Прерывистое строение гена характерно для большинства эукариот. Интроны могут содержать все виды РНК – иРНК, тРНК, рРНК.

Вся совокупность экзонов (кодирующих белки) в геноме человека занимают всего 1,1 – 1,4 %. Средний ген человека содержит 9 интронов. По мере упрощения

организации организмов совокупная величина их экзонов возрастает (например у бактерий она равна 86%).

В вырезании интронов из РНК-транскрипта и сшивании оставшихся экзонов, принимает участие многокомпонентный комплекс. Основными его составляющими являются малые ядерные РНК (мяРНК) и белки-ферменты.

В целом комплекс носит название малые ядерные рибонуклеопротеиды, мяРНП или сплайосома. Сам процесс достаточно сложен и состоит из нескольких этапов (см. рис. 58).

1. Формирование сплайосомы. К началу и концу интрона прикрепляются фрагменты белка и мяРНК (рис. 56, Д) формируя сплайосому. (рис. 56, Д) Прикрепление комплекса мяРНП (рис. 56, Е).

Экзон 1 Интрон Экзон 2

А

Д

Б

Е

В

Петля

интрона вырезана

Г

Ж

Рис. 61. Схема сплайсинга (объяснение в тексте).

2. Сближение соседних экзонов, за счёт образования петли интрона. Разрезание на границе экзон-интрон и соединение соседних (первого и второго) экзонов(рис. 56, В).

3. Удаление и разрушение петли и сплайосоме (рис. 56, Г, Ж).

Необходимо отметить, что при повреждении (мутации) интрона сплайсинг может быть не закончен, интрон не вырезан и конченый продукт – иРНК будет нести несвойственные ей последовательности нуклеотидов. Понятно, что это может привести к нарушению трансляции и выключению из метаболизма определённого белка

е. Альтернативный сплайсинг.

Такой тип сплайсинга происходит при экспрессии одного и того же гена в разных тканях.

Сущность его в том, что один и тот же участок гена в разных тканях может выступать в качестве интрона и экзона. Это приводит к образованию разных иРНК, которые кодируют белки с различной ферментативной активностью.

Так в клетках щитовидной железы синтезируется гормон кальцитонин. Он тормозит высвобождение кальция из костей. Ген, контролирующий синтез каль-

Ген, контролирующий кальцитонин

э и э и э и э и э и э

ДНК

1 2 3 4 5 6

э и э и э и э и э и э

про-иРНК

1 2 3 4 5 6

В щитовидной железе В клетках головного мозга

иРНК

1 2 3 4 1 2 3 5 6

Кальцитонин Кальцитонинподобный белок

Рис.62. Альтернативный сплайсинг кальцитонина и кальцитонин-подобного белка.

цитонина, состоит из 6 экзонов, первичный транскрипт этого гена ( про-иРНК) также состоит из 6 экзонов (рис. 62). Из первичного транскрипта формируется зрелая иРНК содержащая 4 экзона – 1,2,3,4. Экзоны № 5 и 6 были прочитаны как интроны и вырезаны. На основе такой и РНК синтезируется кальцитонин. В клетках головного мозга из первичного транскрипта, содержащего 6 экзонов, формируется зрелая иРНК, состоящая из 5 экзонов – 1,2,3,5,6. Четвёртый экзон был вырезан как интрон. Такая иРНК контролирует синтез кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие.

Другой ген Icarus ( в названного в честь легендарного Икара) способен обеспечить за счёт альтернативного сплайсинга синтез 6 различных полипептидов. Кроме этого полипептиды образуют между собой в клетке около 20 различные ансамбли из одних и тех же полипептидов или различных.

Нарушение механизма сплайсинга может привести к патологическим состояниям, которые носят общее название талассемии. К ним относят заболевания связанные с частичным или полным подавление синтеза одной из цепей гемоглобин ( α- или β-цепей). Например, болезни, связанные с недостатком синтеза β -цепи гемоглобина, могут возникнуть в результате мутаций в двух участка гена, кодирующего β-цепь – в сайте ответственном за полиаденилирование и в одном из интронов. В первом случае нарушается процесс формирования полиаденилового хвостика и формируется неполноценная β-цепь гемоглобина. Во втором случае сплайосома не способна вырезать повреждённый интрон и зрелая иРНК β-цепи гемоглобина не образуется. В любом случае нормальная функция эритроцитов будет существенно нарушена.

20. Трансляция. Характеристика этапов инициации, элонгации и терминации. Особенности трансляции у про- и эукариот

Транскрипция – синтез всех видов РНК на матрице ДНК. Транскрибируемый участок ДНК – наз ген. (транскрипция – процесс перевода ген инф в виде последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК в последовательности нуклеотидов в молекуле иРНК. )

Ген - (от греч. genos - род, происхождение) - основная структурная и функциональная единица наследственности, определяющая развитие данного признака.

1.) инициация – основной фермент транскрипции это РНК полимераза. различают 3 вида РНК: рнк полимераза 1-синтезирует ррнк. Рнк полимераза 2- синтезует ирнк. Рнк полимераза 3-синтез трнк.

Этапы: 1)цепи ДНК расплетаются причем сама рнк полимеризуется обладая геликазной активностью

2)рнк полимераза синтезирует короткий участок рнк 3) синтез идёт быстрее.

(2.) элонгация –синтез в направлении от5\ к 3\ по ирнк по принцепу комплементарности. Новые нуклеотиды поступают в форме нуклеозид 3 фосфатов. Энергия для присоединения нового нуклеотида выделяется при гидролизе 2х последних фосфатных групп.

(3.) терминация – в области терминатора особого участка ДНК происходит образ «шпилек» в молекуле РНК шпильки образ за счет внутрицепочечных водродных связей. Вновь синтезирируемая ДНК отщипляется от РНК. Промотор-регулятор участок ДНК перед структурным геном который не транскрибируется. Функции: указывает точку начала синтеза; указывает смыслов цепь ДНК; инициирует РНК-

22. Регуляция активности генов упрокариот на примере lac-оперона (отрицательная и положительная индукция lac-оперона).

активность генов проявляется на уровне определяемых ими фенотипических эффектах. Мерой активности генов служит функциональная активность белков, контролируемых этими генами.

В механизме регуляции активности генов прокариот большую роль играют особые гены-регуляторы, контролирующие синтез регуляторных белков.

Такие белки, соединяесь с последовательностями промоторов реагируемых генов, способны подавлять или активировать их транскрипцию.

Регуляторные белки, подавляющие транскрипцию структурных генов, наз репрессорами.

Последовательности нуклеотидов регуляторных генов, с которыми взаимодействуют белки репрессоры, получили название операторов.

Регуляция, связанная с подавлением транскрипции, наз негативной.

Регуляторные белки, активирующие транскрипции. структурных генов, наз активаторами. Регуляция, связанная с активацией транскрипции получила наз – позитивной.

К негенетиским факторам регуляции экспрессии генов, или эффектрорам, относятся в-ва небелковой природы. Взаимодействуя с регуляторными бедками, они изменяют их биологическую активность. Различают 2 вида эффекторов: индукторы – «включающие» транскрипцию и корепрессоры, «выкл её».

Функционирование лактозного оперона киш палочки.

Лактозный оперон E coil включ след элементы: 3 гена, кодирующих белки ферменты: B-галактозидазу, пермеазу и трансацетилазу, участвующие в метаболизме лактозы и транспорте её в клетку, и регуляторной области. Регуляторная область, в свою очередь, сост из промотора, оператора- последовательности нуклеотидов для связ белка репрессора, а также последовательности нуклеотидов для связ белка активатора. Активность генов контролир регуляторным геном Lac1.

При выращивании E.coli на среде, содержащей только глюкозу геи- регулятор лак-оперон синтезирует активный белок-репрсссор, который, взаимодействуя с оператором, «выключает» транскрипцию структурных генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме и транспорте лактозы в клетку.

Если клетки E.coli перенести на среду, содержащую только лактозу, то проникая внутрь клеток небольшая часть ее превращается в аллолактозу, которая связываясь с белком -репрессором, инактивируст его. В результате РНК-полимераза осуществляет транскрипцию полицистронной мРНК для синтеза всех ферментов, необходимых для транспорта и метаболизма лактозы.

В данном случает осуществляется негативная регуляция генов оперона. При этом аллолактоза служит ИНДУКАТОРОМ генов лак-оперона, кодирующего белки, участвующие в транспорте и метаболизме лактозы.

При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей как лактозу, так и глюкозу клетки Е coli, используют для гликолиза в основном глюкозу. Указанная особенность метаболизма обусловливается наличием у Е coli механизма положительной регуляции активности генов lac оперона.

23. Регуляция активности генов у прокариот на примере триптофанового оперона.