1. Мета заняття:

   0. Мета загальна. Ознайомитись із загальними принципами діагностики вірусних інфекцій. Вивчити методи індикації та ідентифікації вірусів. Ознайомитися із функцією інтерферону та інтерфероногенів у неспецифічному захисті від вірусних інфекцій. Вивчити основні групи противірусних препаратів, особливості їх застосування.

   1. Мета конкретна.

   2. 1. Вивчити загальні принципи діагностики вірусних захворювань, етапи дослідження.

   3. 2. Оволодіти методами індикації та ідентифікації вірусів

   4. 3. Знати особливості культивування вірусів

   5. 4. Знати методику постановки і перебіг серологічних реакцій, що використовуються для діагностики вірусних інфекцій

   6. 5. Ознайомитися із функцією інтерферону у неспецифічному захисті від вірусних інфекцій.

   7. 6. Вивчити основні групи противірусних препаратів, особливості їх застосування.

2. Базові знання, навички, необхідні для вивчення теми.

3.1. Знати принципи лабораторної діагностики інфекційних захворювань.

3.2. Знати принципи культивування вірусів.

3.3. Знати принципи перебігу серологічних реакцій, їх основні види, компоненти.

3.4. Знати принципи імунологічного захисту організму.

3.5. Знати групи хіміотерапевтичних засобів для лікування інфекційних захворювань.

4.Основні теоретичні питання, що підлягають вивченню.

1. Поняття індикації та ідентифікації вірусів

2. Загальна характеристика методів культивування вірусів.

3. Цитопатична дія вірусів

4. Серологічні реакції, що застосовуються для індикації та ідентифікації вірусів.

5. Інтерферони, інтерфероногени

6. Противірусні хіміотерапевтичні препарати

5.Зміст теми.

Cучасні методи лабораторної діагностики вірусних інфекцій.

Мікроскопічні методи: цитоскопічний, люмінісцентна мікроскопія, електронна мікроскопія, імунна електронна мікроскопія.

Культуральний метод (вірусологічний).

Етапи культурального методу

• Забір матеріалу

• Обробка матеріалу з метою звільнення від супутньої бактеріальної мікрофлори

• Культивування вірусу

• Індикація і титрування вірусу. Їх культивують в чутливих живих

системах, а саме:

1) в організмі лабораторних тварин (білі миші, морські свинки, хом’яки і т. інше); 2) в курячих ембріонах (КЕ) 5-14 денного віку, які заражають декількома способами - в порожнину амніону або алантоїсу, на хоріоналантоїсну оболонку, у жовточний мішок. Алантоїсна і амніотична рідина по закінченню певних термінів інкубації використовується для індикації вірусів.

3) в культурах клітин (КК) - популяція однотипових клітин організму тварини або людини, які вирощуються в штучних умовах. По тривалості життя культури клітин поділяються на: а) первинні - одержують шляхом трипсинізації шматочків тканин; in vitro можуть проходити до 10 поділів; б) напівперещеплювані - диплоїдні клітини одного типу, які здатні перетерплювати до 100 поділів in vitro (культура фібробластів ембріона людини); в) перещеплювані - однотипні пухлинні або нормальні клітини із зміненим каріотипом, спроможні до необмеженого росту in vitro (Hela, Her-2, Vero, Kb і т. д.). Для культивування культур клітин використовують спеціальні поживні середовища, які містять амінокислоти, солі, вуглеводи і мають рН=7,2-7,4, а також індикатор, який змінює колір при зсуві pH. Найбільш поширеним є середовище Ігла і 199 (включає 60 компонентів).

Індикація вірусів - виявлення вірусів у досліджуваному матеріалі без установлення їх приналежності до родини, роду, виду або сероваріанту. Індикація вірусів в організмі лабораторних тварин здійснюється на підставі появи певних ознак захворювання. Після загибелі тварини вірус виявляють у гомогенатах уражених тканин. Індикація у курячому ембріоні: в амніотичній і алантоїсній рідини індикацію здійснюють у реакції гемаглютинації (міксовіруси); на ураженій хоріоналантоїсній оболонці з’являються бляшки або віспини (герпесвіруси). Індикація у культурі клітин здійснюється за:

1) цитопатичною дією віруса (ЦІІД). При мікроскопії препарату, виготовленого із культури клітин, інфікованих вірусом, виявляються клітини з вакуолізованою цитоплазмою, зміненим ядром (меншим за формою, інтенсивністю забарвлення); клітини нерідко втрачають свою типову форму (загальні дистрофічні зміни). ІІри репродукції деяких вірусів в інфікованих клітинах можна виявити включення (цитоплазматичні або ядерні), що також є ознакою ЦПД вірусу. Деякі віруси сприяють утворенню синцитіїв або симпластів у культурі клітин, що можна виявити при мікроскопії. Синцитії утворюються внаслідок злиття декількох клітин, одна з яких або усі інфіковані вірусом. Симпласти - це багатоядерні клітини, які утворюються внаслідок порушення процесів поділу інфікованої вірусом клітини.

2) утворенням бляшок. Бляшки - це осередки зруйнованих інфікованих вірусом клітин моношару, що знаходиться під агаровим покриттям.

3) кольоровою пробою. Середовище Ігла і 199 містять індикатор, який при рН=7,2-7,4 має малиновий колір, а при зсуві pH в кислу сторону (виділення клітинами кислих продуктів метаболізму) змінюється колір на жовтогарячий. Вірусінфіковані клітини внаслідок пригнічення життєдіяльності або загибелі не виділяють кислі продукти, відповідно колір індикатора не змінюється. Таким чином, при інфікуванні вірусом культури клітин, колір індикатора в середовищі Ігла не змінюється.

4) реакцією гемаглютинації (РГА). Виявлення вірусів за допомогою РГА грунтується на спроможності деяких вірусів, які містять гемаглютинін в оболонці, склеювати еритроцити тварин або людей. Для реакції використовують культуральну рідину, в якій містяться віріони, або, якщо вірус культивують у курячому ембріоні, алантоїсну чи амніотичну рідину. В присутності віріонів, які мають на своїй поверхні гемаглютиніни (віруси грипу, парагрипу, кору), відбувається склеювання еритроцитів і утворення пластівців червоного кольору.

5) реакція гемадсорбції (РГАдс). РГадс дозволяє виявити віруси, які містять гемаглютинін, при мікроскопії заражених клітинних культур до розвитку ЦПД. При додаванні до культури клітин завису еритроцитів на інфікованих вірусом клітинах спостерігається адсорбція еритроцитів. Це зумовлено тим, що при репродукції віруса у чутливій клітині, поверхневі рецептори віруса, в тому числі і гемаглютинін, вбудовуються у оболонку інфікованої клітини. Еритроцити будуть фіксуватись тільки на інфікованих вірусом клітинах.

Методи ідентифікації вірусів. Реакція нейтралізації (РН), реакція гальмування гемадсорбції, реакція гальмування гемаглютинації, реакція непрямої гемаглютинації, реакція зв’язування комплементу (РЗК), імуноферментний аналіз (ІФА), радіоімунний аналіз (РІА), імунна електронна мікроскопія (ІЕМ), реакція імунофлюоресценції (РІФ), зустрічний імуноелектрофорез, метод молекулярної гібридизації НК.

Серологічний метод (РЗК, РГГА, РПГА, ІФА, РІА, імуноелектрофорез).

Молекулярно-генетичний метод - реакція гібридизації ДНК або РНК; полімеразно-ланцюгова реакція (ПЛР).

Інтерферони – один із значущих факторів природної неспецифічної резистентності. Представляють собою глікопротеїди, які утворюються в клітинах макроорганізму під дією різних патогенів. Вони активують імунітет, виявляють протимікробну, протипухлинну, виражену противірусну дію. Розрізняють 3 типи інтерферонів: альфа-, бета-, гамма-інтерферон.

Альфа-інтерферон – лейкоцитарний, має виражену противірусну дію і дещо слабшу протипухлинну;

Бета-інтерферон – фібробластний, має більш виражену протипухлинну дію;

Гамма-інтерферон – лімфоцитарний (імунний), має виражені імуномодулюючі властивості (стимулює макрофаги).

Індуктори інтерферону (інтерфероногени): віруси, ЛПС клітинної стінки бактерій, компоненти оболонок грибів, найпростіших, рикетсії,хламідії, природні хімічні речовини (поліфеноли), мітогенні речовини та ін.

Особливістю інтерферонів є те, що вони проявляють активність у клітинах того виду тварин, з якого вони отримані. Тому для лікування людей використовують лише людський інтерферон або виробленний за методом генної інженерії. Противірусну їх дію пояснюють блокуванням синтезу вірусних білків.