10. Зміст теми.

Виявлення вірусів. Для виділення вірусів, необхідних для подальшого їх дослідження з метою ідентифікації, дуже важливо провести правильний забір, швидке транспортування матеріалу до лабораторії, раціональний вибір тест-системи (курячі ембріони, культури клітин, лабораторні тварини). Для вірусологічного дослідження матеріал краще збирати у перші дні захворювання. Від правильного його забору залежить хід подальшого вірусологічного дослідження. Залежно від проявів хвороби досліджуваним матеріалом може бути кров, змиви з носо- і ротоглотки, харкотиння, рідина з пухирців, спинномозкова рідина, сеча, фекалії, шматочки органів і тканин людини, отриманих при дослі­дженні трупів, матеріал від лабораторних тварин тощо. Одержаний матеріал необхідно зберігати за умов збереження активності вірусів. Тому його слід тримати (заморозити) при температурі -20 °С. Для транспортування вірусів можна використати термоси, які заповнюються сухим льодом.

Досліджуваний матеріал, який не контамінується сторонньою флорою (кров, плазма, сироватка, спинномозкова рідина), може бути безпосередньо використаний для зараження тест-систем. Однак у багатьох випадках досліджуваний матеріал (фекалії, змиви з рото­глотки, носових ходів тощо) може містити бактеріальну флору, яка при подальшому зараженні тест-систем спотворюватиме результати досліджень, включаючи їх загибель. Тому в лабораторіях використовують методи знищення бактерій в доставлених взірцях. Надійним методом є обробка матеріалу антибіотиками пеніциліном і Допустимим вважається використання спеціальних антибактеріальних фільтрів або центрифугування матеріалу при невисоких швидкостях. У цьому випадку бактерії опускаються з осадом на дно.

Культивування вірусів.

Культивувати віруси можна тільки на біологічних моделях: у організмі лабораторних тварин, в курячих ембріонах, що розвиваються, і культурах клітин.

Методи культивування і індикації вірусів

1. Культивування вірусів в організмі лабораторних тварин.

2. Культивування вірусів в курячих ембріонах.

3. Культивування вірусів в тканинних культурах.

Клітинна культура - система клітин, що отримується з тканини, знаходиться у вигляді шару клітин, прикріплених до скла, або у вигляді суспензії. Найбільш практичне застосування отримали одношарові культури первинно-трипсинізованих клітин і ліній клітин, що перевиваються. Суть методів при приготуванні первинних культур тканин полягає в руйнуванні міжклітинної тканини і роз'єднуванні клітин для подальшого отримання моношару. Роз'єднування клітин проводиться шляхом дії на тканину протеолітичних ферментів (трипсину). Для культивування культури клітин застосовують синтетичні живильні середовища - 199, Ігла, Хенкса, Ерла (ці середовища мають амінокислоти, вітаміни, глюкозу, мінеральні солі). Зміна живильного середовища проводиться через 2-3 дні.

1. Первинні (трипсинізовані) культури клітин - у яких міжклітинні зв'язки руйнують ферментами (трипсином, панкреатином) і отримують моношар клітин на склі.

2. Що перевиваються (стабільні):

а) нормальні (ПКБ - нирки барана; СМЦ - серце мавпи циномольгус);

б) пухлинні - Hela - рак шийки матки; Hep - 1 - епідермоїдний рак гортані; Дейтройт 6 - кістковий мозок хворого на рак легені. Про наявність вірусу в зараженій культурі клітин можна судити за цитопатичною дією (ЦПД) - патологічними змінами морфології клітин, аж до їх загибелі, що виникають в результаті репродукції вірусів, і спостерігаються під мікроскопом: 1. Дегенерація клітин (округлення, зміна форми, руйнування); 2. Поява включень (Ліпшются - вірус герпесу; Гварнієрі - вірус натуральної віспи і тілець Бабеша-Негрі - вірус сказу); 3. Руйнування пласта клітин (параміксовіруси); 4. Утворення гігантських багатоядерних клітин - симпластів (вірус кору). 5. Утворення «негативних колоній», або «бляшкоутворення» - обмежені ділянки зруйнованих вірусами клітин у суцільному моношарі культури клітин. Вони видні неозброєним оком у вигляді світлих плям на тлі забарвленого моношару живих клітин. Додавання агару в живильне середовище обмежує розповсюдження вірусів по всьому моношару після виходу їх із зруйнованої клітини і забезпечує взаємодію вірусів тільки з сусідніми клітинами. Кожна «бляшка» утворюється потомством одного віріона.

Основні методи індикації вірусів в культурі тканин:

1. Гемаглютинація;

2. Гемадсорбція;

3. Реакція нейтралізації вірусів в культурі тканин;

4. Кольорова реакція Солка.

- Реакція гемаглютинації - склеювання еритроцитів при додаванні матеріалу, що містить вірус (є вірус - еритроцити осідають у вигляді “парасольки”; немає вірусу - у вигляді “диска”). - Реакція гемадсорбції - адсорбція еритроцитів на поверхні уражених вірусом клітин і утворення характерних скупчень (вірус грипа викликає аглютинацію еритроцитів островкового типу).

- Кольорова реакція Солка - заснована на зміні кольору живильного середовища. В результаті життєдіяльності клітин в живильне середовище виділяються продукти клітинного метаболізму і відбувається зрушення рН в кислу сторону, про що свідчить зміна кольору середовища з червоного в жовтий. Якщо вірус присутній і реплікується в культурі, то унаслідок руйнуючої дії вірусу клітини дегенеруються, і пригнічується їх метаболізм, тобто колір середовища не змінюється.

Важливим етапом лабораторної діагностики будь-якої вірусної інфекції є виявлення та типування вірусів у досліджуваному матеріалі, яке передбачає використання специфічних противірусних сироваток.

Реакція гальмування гемаглютинації (РГГА). Реакція базується на здатності блокувати гемаглютинуючі властивості вірусів за допомогою специфічних антитіл. У результаті цього спостерігається затримка аглютинації еритроцитів.

Компонентами реакції є невідомі антигени (вірусмісткий матеріал), який може бути збагачений пасажами в культурі клітин, лабораторних тваринах або курячому ембріоні, специфічні імунні противірусні (або проти окремих вірусних антигенів) сироватки, еритроцити. Для розведення компонентів реакції використовують забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2-7,4). Еритроцити отримують із крові птахів (кури, гуси), ссавців (гвінейські свинки), людини (0 група). Їх тричі промивають у стерильному фізіологічному розчині та зберігають у вигляді 0,5-1,0 % суспензії. З метою їх стабілізації еритроцити попередньо обробляють формаліном або глутаровим чи акриловим альдегідом. Реакцію вважають позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. РГГА широко використовують для ідентифікації вірусів грипу, паротиту, енцефалітів та ін.

Реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс). Принцип реакції базується на явищі гемадсорбції. Воно полягає в тому, що еритроцити набувають здатності адсорбуватись на поверхні культур клітин, які зазнали модифікації внаслідок появи в оболонці глікопротеїнів вірусів. Антитіла імунної сироватки при взаємодії з поверхневими антигенами вірусів, представленими в оболонці, зв’язують їх, внаслі­док чого гальмується адсорбція еритроцитів на клітинах. Компонентами реакції є віруси, здатні до гемадсорбції, культура клітин, в якій вони розвиваються, противірусна сироватка з розведенням 1:10 і більше, 0,4‑1,0 % завись еритроцитів півня, гвінейської свинки або людини, тричі відмита фізіологічним розчином або розчином Хенкса. Специфічні сироватки, які використовують у досліді, попередньо обробляють ферментами, які руйнують рецептори, піддають температурному впливу, щоб звільнити від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації. Реакцію ставлять у пробірках або на спеціальних скляних пластинах, на яких є моношар культури клітин. Одна з переваг РГГ_адс полягає в тому, що її можна ставити до появи цитопатичного ефекту.

Розглядаючи пробірки під малим збільшенням мікроскопа, звертають увагу на наявність чи відсутність адсорбції еритроцитів на поверхні клітин. При позитивній РГГ_адс еритроцити вільно плавають у живильному середовищі, при негативній – вони адсорбуються на клітинах. РГГ_адс використовують для ідентифікації збудників парагрипу, паротиту, респіраторно-синцитіальних вірусів та ін.

Реакція нейтралізації. Принцип реакції ґрунтується на взаємодії специфічних антитіл імунної сироватки з вірусом, яке призводить до нейтралізації останнього. Реакцію можна ставити в культурах клітин з обліком результатів за цитопатичною дією, в кольоровій пробі, за допомогою рН-метрії та феноменом бляшкоутворення. При нейтралізації вірусів антитілами специфічної сироватки або при відсутності відповідних вірусів створюються умови для розвитку культур клітин. Вони залишаються живими, активно здійснюють обмін речовин, внаслідок чого утворюються продукти клітинного метаболізму, які зсувають рН середовища в кислу сторону. Це приводить до зміни кольору індикатора фенолроту з червоного (лужне рН) на солом’яно-жовтий або оранжевий (кисле значення рН).

Реакцію зв’язування комплементу досить широко використовують у вірусологічній практиці для ідентифікації хвороботворних агентів. Вона належить до непрямих двосистемних гетерологічних реакцій і ґрунтується на принципі взаємодії комплементу із специфічним комплексом антиген-антитіло. Внаслідок ­цього не відбувається гемолізу сенсибілізованих еритроцитів. Компонентами реакції є вірусмісткий матеріал, специфічна імунна сироватка, комплемент, гемолітична сироватка, еритроцити барана та електроліт. При виконанні реакції в окремих пробірках змішують вірусмісткий матеріал, специфічну імунну сироватку і комплемент у робочій дозі. Після інкубування цієї першої системи до неї додають попередньо сенсибілізовані гемолітичною сироваткою еритроцити барана. Після витримування дослідних пробірок при від­повідній температурі проводять облік результатів.

При утворенні специфічного комплексу між вірусами та імунною сироваткою він набуває здатності адсорбувати комплемент. Тому наступне додавання гемолітичної системи (при відсутності вільного комплементу) не супроводжується лізисом еритроцитів – позитивний результат. Якщо антигени та антитіла є гетерологічними, вільний комплемент зв’язується із сенсибілізованими еритроцитами барана, викликаючи їх гемоліз. Залежно від ступеня вираження гемолізу реакцію оцінюють за 4-плюсовою системою: від “++++” – різко позитивна реакція (прозора рідина і осад еритроцитів) до “–“ – негативна реакція (відсутність осаду еритроцитів, повний гемоліз або “лакова кров”). РЗК використовують майже при всіх вірусних інфекціях.

Реакція непрямої гемаглютинації використовується у вірусологічній практиці для виявлення невідомих вірусних антигенів. Сутність її полягає в тому, що еритроцити тварин або людини, навантажені специфічними противірусними антитілами, здатні взаємодіяти з вірусними антигенами, внаслідок чого вони склеюються і випадають у осад. При позитивній реакції в дослідних лунках спостерігають виражену аглютинацію еритроцитів з утворенням осаду з нерівними хвилястими краями, який розпо­діляється рівномірним шаром по дну пробірки або лунки – “перевернута парасоль­ка”. При негативному результаті – щільний, компактний осад з рівними краями.

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв’язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з’єднання антигена і антитіла з кон’югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂О₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген – антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв’язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Твердофазні імуноферментні методи. Принцип цих методів полягає в наступному. В якості твердої фази (носія) використовують лунки полістиролових планшет, фільтрувальний папір або нітроцелюлозу, на яких адсорбовано антиген чи антитіло. До антигена, який зафіксований на твердій фазі, додають досліджува­ну сироватку, а після інкубації і промивання вносять антитіла проти гамаглобулінів людини, мічені ензимом. Після наступної інкубації і промивання додають ­субстрат для використаного ензиму, який реагує з ним. Спостерігається кольорова реакція, після затримки якої облік проводять візуально або спектрофотометрично.

Дану методику, твердофазного непрямого імуноферментного методу, найчас­тіше використовують для виявлення в сироватці антитіл і характеристики специфічних антитіл у різних класах імуноглобулінів. Особливо важливими є моди­фікації ІФА-IgM з використанням моноклональних антитіл.

Конкурентний твердофазний метод. До антигена, фіксованого на твердому носієві, додають досліджувану сироватку хворого. Специфічні антитіла сироватки зв’язуються з антигенами. Після цього вносять стандартні специфічні антитіла, мічені ферментом. Якщо антитіла сироватки хворого зв’язались з антигеном, мічені антитіла не можуть реагувати з цим антигеном і активність ферменту в луночці буде незначною. При відсутності в сироватці хворого специфічних антитіл, стандартні специфічні антитіла, мічені ензимом, зв’язуються з антигеном, фіксованим на твердій фазі, і при додаванні субстрату для ферменту, спостерігається висока активність ензиму.

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла. Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій – ³H і йод – ¹²⁵J. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників g-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Імуноблотинг. Сучасні методи електрофорезу в гелі дозволяють розділяти біополімери, однак вивчати природу і біологічну активність окремих молекул, які були розділені при електрофорезі досить важко. Це пов’язано з тим, що локалізовані в порах гелю біополімери недоступні для специфічних антитіл, оскільки діаметр пор матриці значно менший за розміри антитіл. У зв’язку з цим було розроблено методику, яка дозволяє вилучати розділені молекули з гелю, переносити і фіксувати їх на поверхні твердої фази у тій послідовності, в якій вони знаходились у гелі. Таким чином, досліджувані антигени, розміщуючись на поверхні нового носія (твердій фазі), стають доступними для наступних досліджень. Процес переносу біополімерів із електрофоретичного геля та імобілізація їх на поверхні пористої мембрани називається блотингом, а одержаний відбиток – блотом.

Для проведення імуноблотингу досліджувані антигени спочатку розділяють з допомогою елетрофорезу в гелі. Одержані фракції електрофоретично ­переносять на листок нітроцелюлози (блот), який знаходиться в спеціальній камері. ­Фіксова­ні блоти обробляють специфічними до антигена антитілами, відмивають і додають ра­діо­активно мічений кон’югат для виявлення антитіл, які зв’язались з антигеном.

Після повторного промивання листок нітроцелюлози розміщують в касеті з рентгенівською плівкою для радіоавтографії. На проявленій плівці появляться смуги локалізації антигена, який зв’язав мічені антитіла.

Реакції гібридизації блотинг – високоспецифічні, їх суть полягає у використанні одноланцюгової нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) (генетичний зонд), яка комплементарно зв’язується з досліджуваною ДНК або РНК.

Генетичні ­зонди, що застосовуються в таких реакціях одержують шляхом клонування плазмід, ­штучно­го синтезу або з використанням техніки ампліфікації генів. Оскільки ДНК на від­міну від РНК складається з двох ланцюгів, то перед дослідженням потрібно розділи­ти дві комплементарні нитки ДНК шляхом нагрівання. Тоді мічена радіоактивним ізотопом або ензимом ДНК може з’єднатись з досліджуваною ДНК.

ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) - даний метод заснований на виявленні в досліджуваному зразку специфічного фрагмента ДНК збудника і на принципі природної реплікації ДНК, що включає розплітання подвійної спіралі ДНК, розбіжність ниток ДНК і комплементарне добудовування обох ниток.