МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

Вінницький національний медичний університет

імені М.І.Пирогова

ЗАТВЕРДЖЕНО

на методичній нараді кафедри

________Мікробіології______

(назва кафедри)

Завідувач кафедри

проф. Г.К.Палій

«_____»____________201_5_р.

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ СТУДЕНТІВ ПРИ ПІДГОТОВЦІ ДО ПРАКТИЧНИХ ЗАНЯТЬ

МОДУЛЬ №3

З__мікробіології, вірусології та імунології___

(назва навчальної дисципліни)

____медичного____факультету

(назва факультету)

Вінниця – 2015

Методичні рекомендації для самостійної роботи студентів медичного факультету при підготовці до практичного заняття №46

1. Тема заняття. Загальна вірусологія. Морфологія та ультраструктура вірусів. Генетика вірусів. Види мінливості.

2. Мета заняття.

0. 2а. Загальна: Ознайомитись з морфологією, ультраструктурою та генетичним апаратом вірусів. Вивчити види мінливості вірусів.

2Б. Конкретна:

1. Трактувати морфологію і ультраструктуру вірусів.

2. Аналізувати особливості взаємодії вірусів з живими системами.

3. Оцінювати результати розмноження вірусів в живих системах.

4. Аналізувати методи культивування вірусів в лабораторних умовах.

3. Базові знання, навички, необхідні для вивчення теми.

1. Інтерпретувати мікроскопічну та субмікроскопічну структуру клітин

2. Пояснювати на молекулярно-біологічному та клітинному рівні закономірності біологічних процесів

3. Трактувати загальні фізико-хімічні закономірності, що лежать в основі процесів розвитку клітин.

4. Визначення понять: “ген”, “геном”, “генотип”, “фенотип”.

5. Позахромосомний генетичний матеріал (транспозони, плазміди).

6. Види модифікацій.

4. Основні теоретичні питання, що підлягають вивченню.

1. Загальна характеристика вірусів, їх основні властивості.

2. Класифікація вірусів. Принципи, покладені в основу.

3. Морфологія і ультраструктура віріона.

4. Хімічний склад вірусів: нуклеїнові кислоти, білки, ліпіди, полісахариди. Їх особливості та функції.

5. Репродукція вірусів у процесі взаємодії їх з клітиною. Основні етапи взаємодії вірусів з клітинами при продуктивній інфекції.

6. Інтегративний та абортивний типи взаємодії вірусів з клітиною господаря.

7. Персистенція вірусу в клітинах.

8. Інтерференція вірусів, дефектні інтерферуючі частки.

9. Організація генетичного апарату вірусів.

10. Форми прояву мінливості вірусів.

11. Види генетичних рекомбінацій у вірусів.

5. Зміст теми.

Віруси - особливе царство організмів ультрамікроскопічних розмірів, що володіють тільки одним типом нуклеїнових кислот, позбавлені власних систем синтезу білка і мобілізації енергії і тому є абсолютними внутрішньоклітинними паразитами. У 1892 р. російський учений-ботаник Д.І. Івановський, вивчаючи мозаїчну хворобу листя тютюну, встановив, що захворювання це викликається найдрібнішими мікроорганізмами, які проходять через дрібнопористі бактерійні фільтри. Ці мікроорганізми отримали назву вірусів (від лат. virus - отрута). Великий внесок до вивчення вірусів внесли вірусологи: М.А. Морозов, Н.Ф. Гамалея, Л.А. Зільбер, М.П. Чумаков, А.А. Смородінцев, В.М. Жданов і ін.

Віруси - найдрібніші мікроби («агенти, що фільтруються»), що не мають клітинної будови, білоксинтезуючої системи, що містять один тип нуклеїнової кислоти (тільки ДНК або РНК). Віруси, будучи облігатними внутрішньоклітинними паразитами, репродукуються в цитоплазмі або ядрі клітини. Вони є автономними генетичними структурами і відрізняються особливим, роз'єднаним (диз'юнктивним), способом реплікації (репродукції): у клітині окремо синтезуються нуклеїнові кислоти вірусів і їх білки, потім відбувається їх збірка у вірусні частинки. Сформована вірусна частинка називається віріоном.

Основними властивостями вірусів є:

1. Ультрамікроскопічні розміри;

2. Вміст нуклеїнової кислоти тільки одного типу (ДНК або РНК);

3. Відсутність здатності до зростання і бінарного ділення;

4. Реплікація шляхом відтворення себе з власної нуклеїнової кислоти генома;

5. Відсутність власних систем мобілізації енергії;

6. Відсутність білок-синтезуючих систем;

7. Віруси - абсолютні внутрішньоклітинні паразити.

Морфологію і структуру вірусів вивчають за допомогою електронної мікроскопії, оскільки їх розміри малі і порівняні з товщиною оболонки бактерій. Розрізняють просто влаштовані віруси (наприклад, віруси поліомієліту, гепатиту А) і складно влаштовані віруси (наприклад, віруси кору, грипу, герпесу, коронавіруси). У просто влаштованих вірусів нуклеїнова кислота пов'язана з білковою оболонкою, званою капсидом (від лат. capsa - футляр). Капсид складається з повторюваних морфологічних суб'одиниць - капсомерів. Нуклеїнова кислота і капсид взаємодіють один із одним і разом називаються нуклеокапсидом. У складно влаштованих вірусів капсид оточений ліпопротеїновою оболонкою - суперкапсидом, або пеплосом. Оболонка вірусу є похідною структурою від мембран вірус-інфікованої клітини. На оболонці вірусу розташовані глікопротеїнові «шпильки», або «шипики» (пепломери, або суперкапсидні білки). Під оболонкою деяких вірусів знаходиться М-білок. Таким чином, просто влаштовані віруси складаються з нуклеїнової кислоти і капсида. Складно влаштовані віруси складаються з нуклеїнової кислоти, капсида і ліпопротеїнової оболонки. Віріони мають спіральний, ікосаедричний (кубічний) або складний тип симетрії капсида (нуклеокапсида). Спіральний тип симетрії обумовлений гвинтоподібною структурою нуклеокапсида (наприклад, у вірусів грипу, коронавірусів). Ікосаедричний тип симетрії обумовлений утворенням ізометрічного полого тіла з капсида, що містить вірусну нуклеїнову кислоту (наприклад, у вірусу герпесу). Капсид і оболонка (суперкапсид) захищають віріони від дії навколишнього середовища, обумовлюють виборчу взаємодію (адсорбцію) з певними клітинами, а також антигенні і імуногенні властивості віріонів. Внутрішні структури вірусів називають серцевиною. У аденовірусів серцевина складається з гистоноподібних білків, пов'язаних з ДНК, у реовірусів - з білків внутрішнього капсида. Форма віріонів може бути різною: паличкоподібною (ортоміксовіруси, параміксовіруси, коронавіруси), пульоподібною (рабдовіруси), сферичною (віруси поліомієліту, ВІЛ, аденовіруси), нитевидною (філовіруси), у вигляді сперматозоїда (бактеріофаги).

Розміри вірусів визначають за допомогою електронної мікроскопії, методом ультрафільтрації через фільтри з відомим діаметром пір, методом ультрацентрифугування. Найбільш дрібними вірусами є парвовіруси (18 нм) і вірус поліомієлиту (близько 20 нм), найбільш великим - вірус натуральної віспи (близько 350 нм).

Розрізняють віруси, що містять ДНК або РНК. Вони зазвичай гаплоїдні, тобто мають один набір генів. Виключенням є ретровіруси, що мають диплоїдний геном. Геном вірусів містить від шести до декількох сотень генів і представлений різними видами нуклеїнових кислот: двонитковими, однонитковими, лінійними, кільцями, фрагментованими. Серед РНК-вмісних вірусів розрізняють віруси з позитивним (плюснитка РНК) геномом. Плюс-нитка РНК цих вірусів виконує спадкову (геномну) функцію і функцію інформаційної РНК (іРНК). Є також РНК-вмісні віруси з негативним (мінус-нитка РНК) геномом. Мінус-нитка РНК цих вірусів виконує тільки спадкову функцію. Геном вірусів здатний включатися в геном клітини у вигляді провіруса, проявляючи себе генетичним паразитом клітини. Нуклеїнові кислоти деяких вірусів, наприклад, вірусів герпесу, можуть знаходитися в цитоплазмі інфікованих клітин, нагадуючи плазміди.

У вірусології використовують наступні таксономічні категорії: сімейство (назва закінчується на viridae), підродина (назва закінчується на virinae), рід (назва закінчується на virus). Проте назви родів і особливо підродин є не для всіх вірусів. Вид вірусу не отримав біномінальної назви, як у бактерій.

У основу класифікації вірусів покладені наступні категорії:

• тип нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), її структура,

• кількість ниток (одна або дві),

• особливості відтворення вірусного генома,

• розмір і морфологія віріонів,

• кількість капсомерів і тип симетрії нуклеокапсида,

• наявність оболонки (суперкапсида),

• чутливість до ефіру і дезоксихолату,

• місце репродукції в клітині,

• антигенні властивості і ін.

Іншими незвичайними агентами, близькими до вірусів, є віроїди - невеликі молекули кільцевої РНК, що суперспіралізована, вони не містять білка і викликають захворювання рослин.

Розрізняють три типи взаємодії вірусу з клітиною: продуктивний, абортивний і інтеграційний. 1. Продуктивний тип - завершується утворенням нового покоління віріонів і загибеллю (лізисом) заражених клітин (цитолітична форма). Деякі віруси виходять з клітин, не руйнуючи їх (нецитолітична форма). 2. Абортивний тип - не завершується утворенням нових віріонів, оскільки інфекційний процес в клітині уривається на одному з етапів. 3. Інтеграційний тип, або вірогенія - характеризується вбудовуванням (інтеграцією) вірусної ДНК у вигляді провіруса в хромосому клітини і їх сумісним співіснуванням (сумісна реплікація).

Репродукція вірусів

І. Продуктивний тип взаємодії вірусу з клітиною, тобто репродукція вірусу (лат. re - повторення, productio - виробництво), проходить у 6 стадій:

1) адсорбція віріонів на клітині;

2) проникнення вірусу в клітину;

3) «роздягання» і вивільнення вірусного генома (депротеїнізація вірусу);

4) синтез вірусних компонентів;

5) формування віріонів;

6) вихід віріонів із клітини.

ІІ. Абортивний тип взаємодії вірусів з клітиною. Цей тип взаємодії не завершується утворенням вірусного потомства і може виникати при наступних обставинах:

1) зараження чутливих клітин дефектними вірусами або дефектними віріонами;

2) зараження стандартним вірусом генетично резистентних до нього клітин;

3) зараження стандартним вірусом чутливих клітин в непермісивних (що не дозволяють) умовах.

Розрізняють дефектні віруси, дефектні віріони і псевдовіріони.

Дефектні віруси існують як самостійні види, які репродукуються лише за наявності вірусу-помічника (наприклад, вірус гепатиту D репродукується тільки у присутності вірусу гепатиту В). Дефектні віріони зазвичай позбавлені частини генетичного матеріалу і можуть накопичуватися в популяції багатьох вірусів при множинному зараженні клітин. Псевдовіріони - це віруси, в капсид яких поміщена нуклеїнова кислота клітини господаря, а не вірусна нуклеїнова кислота.

ІІІ. Інтеграційний тип взаємодії вірусів з клітиною (вірогенія). Це взаємне співіснування вірусу і клітини в результаті інтеграції нуклеїнової кислоти вірусу в хромосому клітини господаря. При цьому інтегрований геном вірусу реплікується і функціонує як складова частина генома клітини.

Генетика вірусів

Способи збільшення інформації:

• дворазове зчитування одієї іРНК з інших ініціюючих кодонів

• зсув рамки трансляції

• сплайсинг (вирізання інтронів)

• транскрипція з ділянок ДНК, що перекриваються

У вірусів можуть бути:

• Модифікації (зміна складу білків капсиду, суперкапсиду під впливом клітин)

• Мутації (розмір бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність для тварин, чутливість до дії хіміотерапевтичних агентів, ts-мутації – температурочутливі – вірус втрачає здатність розмножуватись при підвищених температурах

• Рекомбінації

 Види генетичних рекомбінацій у вірусів

  1. Рекомбінація: Обмін генами (міжгенна) та їх частинами (внутрішньогенна)

Схрещування близьких за властивостями вірусів при одночасному культивуванні.

Наприклад, віруси поліомієліту ( збільшена і зменшена чутливість до гуанідіну, різна нейровірулентність), віруси грипу (різна нейровірулентність для мишей, але одна пневмотропність), гібридизація вірусів віспи кролика і вірусу вісповакцини.

  2. Множинна реактивація: вірусна інфекція викликається при зараженні віріонами з пошкодженим геномом, оскільки функцію цього гену виконує вірус, у якого ген не пошкоджено. Нащадки – неушкоджені віруси.

  3. Пересортування генів: між вірусами, що мають сегментовані геноми (віруси грипу людини, кочок, свиней, буньявіруси, аренавіруси, реовіруси). Гібридні форми називають реасортанти.

  4. Гетерозиготність: одночасній репродукції декількох віріонів, різних за спадковими властивостями, утворюються віріони, що містять певний геном одного із батьківських штамів і частину геному іншого вірусу (т.з. диплоїдні або поліплоїдні віруси). Таке об’єднання не спадкується, але дозволяє дати нащадків з різними властивостями.

  Це віруси грипу, хвороби Ньюкасл

 5. Транскапсидація: частина чужерідного генетичного матерілау, заключеного всередині капсиду іншого вірусу, здатна переноситься в стабільній формі в чутливі до основного вірусу клітини.

Аденовіруси людини не розмножуються в клітинах мавп. Але при одночасному культивуванні аденовірусів та вірусів SV-40 під одним капсидом утворюється вірус, що містить геноми обидвох вірусів, який здатний розмножуватись у клітинах мавп.

  6. Крос-реактивація (рятування маркера): реактивація інактивованого геному неінактивованим (подібно до множинної реактивації)

 Види негенетичної взаємодії вірусів

     1. Фенотипове змішування.

     2. Негенетична реактивація.

     3. Комплементація.

     4. Стимуляція.

     5. Інтерференція.

3. Практичні роботи, які виконуються на занятті.

1. Вивчити морфологічні та структурні особливості вірусів

2. Вивчення основних етапів взаємодії віруса з чутли­вими клітинами. Користуючись таблицями, скласти схеми репліка­ції РНК- та ДНК-вмісних вірусів.

3. Замалювати основні морфологічні ти­пи віріонів

4. Замалювати в протоколі етапи взаємодії віріону з чутливими кліти­нами і реплікацію.

3. Рекомендована література.

7а. Основна:

1. Медична мікробіологія, вірусологія, імунологія. За ред. акад.. НАН України В.В.Широбокова. Вінниця. Нова книга.2011.- С.109-118, 151-156

2. К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, К., 1982. Стор. 38-41, 44, 96-114

3. С.І.Климнюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоков. Практична мікробіологія. Тернопіль, 2004. Стор.316-321.

7б. Додаткова

1. Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Загальна ред.. Г.К.Палій, К., 2004.

2. Лекційний матеріал.