Номенклатура ферментов.

Существует два типа названий ферментов:

1) рабочее, или тривиальное;

2) систематическое.

Рабочее название – название S + тип реакции + окончание аза. Лактат + реакция дегидрогенизации + аза ЛДГ.

Для некоторых ферментов оставлены их рабочие названия: пепсин, трипсин и т.д.

Систематическое название – название обоих S + тип реакции + аза. -Лактат (S₁): НАД⁺ (S₂) – оксидоредуктаза.

Систематическое название дается только тем ферментам, структура которых полностью изучена. В одной клетке находится ~ 10⁴ молекул ферментов, катализируется ~ 2000 разных реакций. В настоящее время известно около 1800 ферментов, в кристаллическом виде получено ~ 150 ферментов.

7. Изоферменты – это молекулярные формы ферментов, возникающие вследствие генетических различий в ПС ферментного белка. Это группа ферментов, которые присутствуют внутри одного вида (ЛДГ) или внутри одной клетки (аминотрансферазы), имеют одинаковый механизм действия, но отличаются по некоторым физико-химическим свойствам: электрофоретической подвижности, иммунобиологическим реакциям. Например, существует в виде пяти изоферментов. Хотя они катализируют одну и ту же реакцию, отличаются по своей Кт. У них одинаковая Mr (134.000) и по 4 ППЦ с Mr 33.500. Пять изоферментов соответствую пяти различным комбинациям двух разных типов ППЦ, названных M – (muscle) и H– (heart) цепями. Изофермент М₄ – находится в мышечной ткани, содержит идентичные 4М-цепи; Н₄ – находится в сердце, содержит идентичные 4Н-цепи. Остальные три изофермента – это различные сочетания М₃Н; М₂Н₂; МН₃. Два типа цепей – М и Н, кодируются двумя различными генами, сочетание ППЦ находится под генетическим контролем. Наличие изоферментов и изменение их соотношения в организме – один из способов регуляции ферментов. Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.

2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.

Большинство ферментов имеет внутриклеточную локализацию и распределены в организме неравномерно. Все ферменты одного метаболического пути, как правило, находятся в одном отделе клетки. Особенно разделение метаболических путей важно для противоположно направленных катаболических и анаболических процессов. Например, синтез жирных кислот происходит в цитоплазме, а их распад в митохондриях. Если бы такого разделения не существовало, образовывались бы бесполезные с функциональной и энергетической точки зрения пути.

В метаболических путях продукт первой ферментативной реакции служит субстратом второй и так далее до формирования конечного продукта. Промежуточные продукты метаболического пути могут высвобождаться из последовательности реакций и использоваться в других метаболических путях, т.е. метаболические пути связаны между собой промежуточными продуктами

Ядро - ферменты, связанные с синтезом молекул ДНК и РНК, в ядре хранится генетическая информация, происходят процессы репликации ДНК, транскрипции (образование мРНК и тРНК, рРНК образуется в ядрышке), созревание первичных транскриптов;

Цитоплазма – распад углеводов (гликолиз, апотомический распад) и их синтеза (глюконеогенез, биосинтез гликогена), синтез жирных кислот и липидов, превращение аминокислот;

Митохондрии - ферменты ЦТК (матрикс), во внутренней мембране митохондрий - ферменты цепи переноса электронов; а также процессы: окислительное фосфорилирование, окислительное декарбоксилирование пирувата, бета-окисление жирных кислот;

Микросомная часть клетки (ЭПС, рибосомы) – биосинтез белков, стероидов, нуклеотидов, метаболизм (окисление) ксенобиотиков;

Аппарат Гольджи - синтез полисахаридов и гликопротеинов;

Лизосомы - гидролитические ферменты обеспечивают процессы разложения (гидролиза) веществ;

Пероксисомы - обезвреживание пероксида водорода и радикалов кислорода.

Некоторые биохимические процессы начинаются в одном компартменте клетки, а завершаются в другом. Частично протекают в цитоплазме, а частично в митохондриях - биосинтез мочевины, биосинтез гема, полный аэробный дихотомический распад глюкозы, глюконеогенез.

7. Определение активности ферментов

Определение количественного содержания ферментов в биологических объектах представляет определенные трудности, поскольку, за редким исключением, ферменты в тканях присутствуют в тканях в ничтожно малых концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости катализируемой реакции в определенных согласованных условиях измерения. При оптимальных условиях: температура, рН среды и полном насыщении фермента субстратом, скорость катализируемой реакции прямо пропорциональна концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции. Для выражения концентрации фермента и количественной оценки его активности в условных единицах комиссией по ферментам Международного биохимического союза была рекомендована стандартная международная единица Е.

Единицы ферментативной активности

За единицу ферментативной активности (Е) принимают количество фермента, катализирующего превращение 1 микромоля субстрата за 1 мин:

, (1)

где М – количество превращенного субстрата, мкмоль;

t – время инкубации, мин.

В связи с введением Международной системы единиц (СИ) предложено выражать активность фермента в каталах (кат, kаt): Е_кат есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю в 1 с. (1 моль/с). Отношение международной единицы (Е) к каталу можно выразить следующим образом: 1 кат = 1 мольс^–1 = 60 моль мин^–1 = 6010⁶мкмольмин–1 = 610^–7 Е, или 1Е = 1 мкмольмин^–1 = (1/60) мкмоль е^–1 = (1/60) мккат =16,67 нкат. Таким образом, 1Е фермента соответствует 16,67 нкат.

Для выражения активности в практической работе с ферментами пользуются понятиями удельной и молярной активности.

Удельную активность фермента определяют путем деления числа единиц ферментативной активности на массу белка (или ткани), г или мг.

, (2)

где Е – число единиц ферментативной активности;

m – масса белка (ткани), г или мг

Молярную активность фермента определяют путем деления числа единиц ферментативной активности в образце на массу фермента, выраженную в микромолях (для очищенных ферментов):

, (3)

где Е – число единиц ферментативной активности;

m – масса фермента, мкмоль.

7. Деградация ферментов в обычных условиях имеет, по-видимому, более случайный характер. Для каждого отдельного фермента существует своя скорость деградации, однако последняя в целом зависит от размера белка: больше белка деградируют быстрее, ка это и должно быть поскольку скорость зависит от частоты случайных столкновений с протеолитическими ферментами. Вследствие удивительно постоянной скорости деградации и строго контролируемой скорости синтеза полупериоды жизни различных ферментов в тканях животных изменяются от минут до нескольких дней.

Число белков, одновременно присутствующих в клетке, может достигать нескольких сотен и даже тысяч. В сбалансированном состоянии концентрация каждого белка составляет от нескольких сотых до нескольких десятых процента от суммы всех белков. Если же в клетке возникает недостаток какого-либо жизненно важного соединения, в ней начинается усиленный синтез ферментов, способствующих образованию именно этого соединения. Так, при недостатке в клетке фосфорной кислоты (необходимой для образования АТФ) начинается усиленный синтез фосфатазы, вызывающий омыление эфиров фосфорной кислоты и выделение фосфатов в свободном состоянии. Количество фосфатазы при этом может увеличиться в 50—100 раз и достигнуть 5 % от всех белков клетки. Весьма значительно изменяется содержание окислительно-восстановительных ферментов, дегидрогеназ, зависящее от интенсивности окислительно-восстановительных процессов в клетке. Чем активнее клетка окисляет субстрат, тем выше в ней концентрация дегидрогеназ. (Благодаря этому оказалось возможным характеризовать степень активности ила на очистных сооружениях по содержанию в нем дегидрогеназ. Чем интенсивнее ил перерабатывает загрязнения, тем выше его дегидрогеназная активность).

Все протекающие в клетке химические реакции хорошо сбалансированы друг с другом. Это свидетельствует о существовании в клетке ряда систем автоматического регулирования, управляющих кинетикой обменных процессов. Гипотезу регулирования синтеза ферментов в клетке предложили французские ученые Ф. Жакоб и Ж. Моно. Согласно этой гипотезе, все гены, ответственные за синтез какого-либо соединения, располагаются в молекуле ДНК последовательно один за другим, в порядке действия ферментов. Так как эти гены определяют структуру фермента, их называют структурными (рис. 22). Кроме них существует еще и ген-оператор, «включающий» и «выключающий» структурные гены. Ген-оператор ответственен за одновременную активность структурных генов. Он располагается на одном конце цепи структурных генов и непосредственно воздействует на них. Не исключено, что ген-оператор не самостоятельный ген, а входит в первый структурный ген. Структурные гены и ген-оператор вместе составляют оперон. Установлено, что сигнал на включение и выключение ген-оператор получает извне, от так называемого гена-регулятора, который располагается в той же молекуле ДНК, но на некотором расстоянии от оперона. Ген-регулятор действует на оперон посредством вещества, выделяемого им в цитоплазму. Вещество, влияющее на оперон и подавляющее синтез ферментов, называется репрессором. Оно, как многие ферменты, состоит из двух компонентов: первый выделяется геном-регулятором, а второй является низкомолекулярным соединением. По аналогии с ферментами компоненты репрессора называются апорепрессором (выделяется геном-регулятором) и корепрессором. В отдельности каждый из них неактивен, но, соединяясь вместе, они образуют активный репрессор. В качестве корепрессора обычно выступает конечный продукт реакции, осуществляемой с помощью данного оперона.