1. Биокатализ (biocatalysis) [греч. bio(s) — жизнь и katalysis — разрушение] — ускорение с помощью ферментов химических реакций, протекающих в живых организмах. Б. — процесс высокоэффективный, специфичный и, в отличие от химического катализа, происходит в более «мягких» условиях, т. е. условиях, свойственных живому организму. Ферменты, или энзимы – это белковой природы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. Слово фермент происходит от лат. fermentum – закваска, другое название ферментов – энзимы от греч. en zyme – в дрожжах. Впервые ферментативные процессы были открыты в бродильном производстве. Современная ферментология или энзимология – это наука о ферментах, их структурной организации. Она решает задачи изучения механизмов действия ферментов, путей регуляции ферментной активности.

Являясь катализаторами, то есть веществами, ускоряющими реакции, ферменты имеют ряд общих свойств с химическими небиологическими катализаторами.

1. Ферменты и входят в состав конечных Р и выходят из реакции в неизменном виде, они не расходуются в процессе катализа.

2. Ферменты не могут возбудить реакций, противоречащим законам термодинамики, они ускоряют только те реакции, которые могут протекать и без них.

3. Ферменты, как правило, не смещают положения равновесия реакции, а лишь ускоряют его достижение.

Вместе с тем ферменты обладают и специфическими свойствами:

1. По химическому строению ферменты являются белками (99,9).

2. Эффективность ферментов на несколько порядков выше, чем небиологических катализаторов.

3. Высокая специфичность – каждый фермент катализирует одну единственную реакцию или одну группу реакций, тогда как неорганические катализаторы действуют при различных типах реакций.

4. Ферменты катализируют реакции в «мягких» условиях: при нормальном Р, рН = 7,0. Для неорганических катализаторов присуща необходимость экстремальных значений рН, нагревание до очень высоких температур.

Химическая природа и строение ферментов.

Важным доказательством белковой природы ферментов явились работы Пастера (инактивация ферментов брожения при кипячении), Павлова (доказал белковую природу пепсина – фермента желудочного сока) и т.д.

1) важный признак белковой природы ферментов – их большая Mr. Например, у ДГ Mr = 4 10⁶; 4,8 10⁵ и т.д.

2) растворы ферментов имеют коллоидный характер – они не проходят через полунепроницаемую мембрану, осаждаются из растворов теми же реактивами, что и белки;

3) ферменты денатурируют и теряют свою активность под влиянием высокой температуры, УЗ, сильных щелочей и других факторов;

4) ферменты, как и белки, обладают амфотерными свойствами, электрофоретической подвижностью и рI.

5) как и белки, ферменты обладают высокой специфичностью;

6) наконец, прямым доказательством белковой природы ферментов явился искусственный синтез ферментов (рибонуклеаза, лизоцим), которые не отличаются по свойствам и биологической активности от природных аналогов.

Ферменты
простые белки	сложные белки
состоят только из ППЦ	состоят из ППЦ + небелковый компонент
(гидролитические ферменты – пепсин, трипсин, уреаза и др.) или ферменты–протеины	(ацетил КоА, лактат ДГ и т.д.) или ферменты–протеиды

2. Вероятность протекания химической реакции определяется разницей между свободной Е исходных веществ и свободной Е продуктов реакции. Ферменты ускоряют химические реакции за счет энергии активации – Е_а.

Е_а – это дополнительная энергия, необходимая для перевода всех молекул одного вещества в активное состояние при данной температуре. (Аррениус – понятие об Е_а).

Таким образом, V_фр зависит от энергетического барьера, который необходимо преодолеть реагирующим веществам, причем высота этого барьера неодинакова для различных реакций.

Чем выше энергия активации, тем медленнее протекает реакция. E_a не виляет на изменение свободных ферментов исходных веществ и продуктов реакции, то есть ∆G, то есть энергетическая возможность реакции не зависит от фермента.

Фермент понижает E_a (пик 2), то есть снижает высоту барьера в результате чего возрастает доля реакционноспособных молекул, а, следовательно, увеличивается V_фр. Чем больше снижается E_a, тем эффективнее действует катализатор и тем больше ускоряется реакция.

S - исходный субстрат P – конечный продукт ΔG – стандартное изменение свободной энергии Еа нфр – энергия активации неферментативной реакции Еа фр – энергия активации ферментативной реакции

3. Специфичность действия ферментов

Понятие Е·S комплекса и АЦФ тесно взаимосвязаны с особым свойством ферментов – их специфичностью. По степени специфичности (в порядке ее снижения) различают:

I. Стереохимическую субстратную специфичность – в этом случае ферменты катализируют только 1 форму S (1 изомер). Например, фумаратгидратаза катализирует только превращение фумаровой кислоты, но не катализирует превращение ее изомера – малеиновую кислоту.

II. Абсолютную субстратную специфичность – Е превращает только 1S. Например, уреаза превращает только мочевину.

III. Абсолютная групповая S-ную специфичность. Ферменты действуют на группу сходных S-в. Например, алкоголь ДГ превращает не только этанол, но и другие алифатические спирты.

IV. Относительную групповую S-ную специфичность. Фермент воздействует не на группу молекул S, а на определенные связи определенных групп S-в. Например, пепсин и трипсин специфичны по отношению к пептидным связям в различных белках.

V. Относительную S-ную специфичность. Фермент катализирует, превращаясь в S-в, относящимся к различным группам химических соединений. Например, фермент цитохром-450 катализирует реакции гидроксилирования до 7000 разных S-в. Это наименее специфичная ферментная система.

Существует две теории объяснения специфичности ферментов.

Гипотеза Э. Фишера – гипотеза «ключа и замка» или гипотеза «шаблона». По Фишеру, фермент – это жесткая структура, АЦФ которого - точный «слепок» S-та. Если S подходит к Е как ключ к замку, то реакция произойдет. Если же S немного изменен («ключ»), то он не соответствует АЦФ («замку»), и реакция становится невозможной. Несмотря на логичность такого объяснения, гипотеза Фишера не объясняет, на чем тогда основаны абсолютная и относительная групповая специфичность. Например, цитохром-450 соединяется с таким большим количеством S-в, различных по строению.

Эти внешние противоречия объясняет гипотеза Кошленда, или гипотеза вынужденного соответствия. По мнению Кошленда, молекула фермента не «жесткая», а гибкая структура и конфигурация фермента и его АЦФ начинают изменяться в момент присоединения фермента к S или другим лигандам. При образовании Е-S комплекса кроме геометрической комплементарности имеет место и электростатическая, которая осуществляется благодаря спариванию противоположно заряженных молекул Е и S. В действительности, видимо, имеют место оба варианта присоединения.

Гипотеза Кошленда позволяет объяснить, почему происходит превращение близких аналогов S-в. Если «ложный» субстрат (квази-S) отличается от природного и АЦФ принимает конформацию близкую к истинному субстрату, то расстановка каталитических групп в таком Е-S комплексе позволит осуществить реакцию. Этот «обман» фермент как бы не замечает, хотя реакция идет и не так быстро, как с истинным субстратом. Если конфигурация квази субстрата не позволяет правильно расположиться каталитической группе, то в этом случае реакция не пойдет. Т.е. если диапазон конформационных перестроек ограничен до одной единственно возможной, то фермент высокоспецифичен, а если возможности перестройки АЦФ велики, то фермент срабатывает и на квази субстраты.

4. Являясь катализаторами, то есть веществами, ускоряющими реакции, ферменты имеют ряд общих свойств с химическими небиологическими катализаторами.

1. Ферменты и входят в состав конечных р и выходят из реакции в неизменном виде, они не расходуются в процессе катализа.

2. Ферменты не могут возбудить реакций, противоречащим законам термодинамики, они ускоряют только те реакции, которые могут протекать и без них.

3. Ферменты, как правило, не смещают положения равновесия реакции, а лишь ускоряют его достижение.

Вместе с тем ферменты обладают и специфическими свойствами:

По химическому строению ферменты являются белками (99,9).

Эффективность ферментов на несколько порядков выше, чем небиологических катализаторов.

Высокая специфичность – каждый фермент катализирует одну единственную реакцию или одну группу реакций, тогда как неорганические катализаторы действуют при различных типах реакций.

Ферменты катализируют реакции в «мягких» условиях: при нормальном Р, рН = 7,0. Для неорганических катализаторов присуща необходимость экстремальных значений рН, нагревание до очень высоких температур.

Зависимость V_фр от рН-среды

Для каждого фермента имеется свой оптимум рН, при котором Vфр максимальна. Отклонение рН в ту или другую сторону ведет к снижению активности фермента. Большая часть ферментов имеет рН~7,0 то есть он совпадает с физиологическими значениями рН.

При оптимальном значении рН функциональные группы АЦФ и сам S находятся в наиболее предпочтительной для связи форме. Некоторые ферменты имеют оптимальную рН, резко отличающиеся от физиологических значений, пепсин на 100% активен при рН = 1,5-2,5; аргиназа – при рН = 10.

Зависимость V_фр от температуры

С повышением температуры среды Vфр увеличивается, достигает оптимальных величин ~ 20-40ºС для большинства ферментов. Термолабильность ферментов связана с их белковым строением: при повышении температуры до 40-50ºС и выше, происходит их денатурация.

Для некоторых ферментов денатурации наступает при 0ºС.

Для любых химических реакций при повышении температуры на каждые 10ºС V реакции увеличивается в 2-3 раза, для ферментативных реакций этот коэффициент ниже – 2 и даже меньше. Исключение: термостабильный фермент адениматциклаза выдерживает температуру 100ºС, а фермент каталаза активен при 0ºС.

Зависимость V_фр от конц. S.

Механизм действия ферментов описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Установить зависимость V_фр от [S] можно графически.

а) по кривой Михаэлиса: чем меньше Km, тем больше Vm и тем выше сродство E к S. Vmax соответствует состоянию полного насыщения фермента S-том. в растворе избыток Е (3 мол S, 5 мол Е) это участок насыщения фермента S-том.

б) методом обратных величин Лайнцивера-Берка, где зависимостьV_фр от [S] рассчитывают в обратных величинах.

При низкой [S] V_фр прямо пропорциональна [S] в каждый данный момент времени (реакция 1-го порядка).

Из уравнения Михаэлиса-Ментен также следует, что при низком значении К_м и высоком значении [S] V_фр является максимальной (в) и не зависит от [S] – это реакция нулевого порядка. Реакция нулевого порядка соответствует явлению, которое называется полным насыщением фермента субстратом.

Гипербола, выражающая зависимость V_фр от [S], называется кривой Михаэлиса. Чтобы правильно определить активность ферментов, нужно добиться реакции нулевого порядка, то есть определять V_фр при насыщающих концентрациях S.

Км численно равна [S] (моль(л)), при которой V реакции равна половине от максимальной. Для определения численного значения Км находят ту [S], при которой Vфр составляет от ½ от Vmax. Таким образом, определение Км играет важную роль для выяснения МД модификаторов на активность фермента.