Приступая к работе, следует протереть стол влажной тканью, а рукава одежды засучить или подтянуть.

Сосуд с исследуемым материалом, пробирки с питательной средой, чашки следует открывать лишь по мере надобности и ненадолго, избегая тем самым попадания в них микроорганизмов извне.

При открывании колб и пробирок ватную пробку берут за верхнюю часть, зажимая ее между двумя пальцами правой руки – мизинцем и безымянным или между мизинцем и ладонью; вынимают пробку над пламенем газовой горелки, а край горлышка открытого сосуда слегка обжигают в пламени. Стерильный конец пробки следует оберегать от заражения микроорганизмами (нельзя класть пробку на стол, касаться концом ее предметов).

Бактериологическая петля перед взятием посевного материала должна быть прокалена докрасна по всей длине. Стеклянную палочку при этом следует держать наклонно, не накаляя ее, и только 1-2 раза провести через пламя.

3. Последовательность операций при посеве:

• вынуть из бумаги чашки Петри и поставить их в ряд;

• расплавить мясо-пептонный агар на водяной бане при 100^о С и охладить примерно до 60^о С, быстро разлить его в чашки, слегка приоткрывая их; помнить, что агаризованная среда застывает при температуре около 40^оС;

• взять покаленной петлей каплю исследуемого материала, предварительно перемешав его взбалтыванием;

• быстро внести посевной материал в жидкость МПА путем погружения в него петли и помешав ею, закрыть чашку; обмыть в первой чашке петлю перенести во вторую и далее в третью чашку, последовательно ополаскивая ее каждый раз в МПА;

• тотчас (пока среда не застыла) перемешать поочередно содержимое чашек осторожным вращением или покачивание их так, чтобы распределить питательную среду по всему дну чашек; остерегаться при этом выплеснуть среду через края чашек; поставить закрытые чашки на стол и держать в покое до полного застывания среды;

• наклеить на боковую стенку крышек чашек этикетки с обозначением номера чашки, фамилии студента, номера группы;

• после застывания среды чашки перевернуть вверх дном, так как при застудневании агара на внутренней стороне крышки образуется большое количество конденсационной воды, которая, оседая в виде капель, может с нее стекать на питательную среду и размыть колонии, смешав их микроорганизмы;

• поставить перевернутые чашки (собрав их стопкой) в термостат с температурой около25^оС для выращивания микроорганизмов.

Если проводиться выделение чистых культур бактерий, содержащихся в воздухе, то посев делается следующим образом. Расплавленный МПА выливают из пробирок в чашки и распределяют его равномерно по всему их дну покачиванием чашек. Затем все чашки одновременно открывают, чтобы микроорганизмы воздуха оседали на среду. Закрывают чашки поочередно через разные промежутки времени – через 3,6,10 минут.

4. Последовательность проведения опыта записать.

Контрольные вопросы:

1. Что называется чистой культурой микроорганизмов?

2. Каково назначение чистых культур микроорганизмов?

Занятие второе.

Изучение колоний бактерий и выделение бактерий в чистую культуру.

План занятия:

1. Изучить выросшие колонии микроорганизмов.

2. Выделить чистую культуру бактерий.

Методические указания:

1. Просмотреть чашки невооруженным глазом, а затем через лупу.

2. Выбрать чашку с обособленными колониями, выявить число их типов и сравнить колонии по следующим признакам :

• форме (круглая, корневидная и др.);

• окраске (в отраженном свете);

• строению и характеру поверхности (гладкая, зернистая, концентрическая, матовая, блестящая и др);

• характеру края (ровный, зубчатый, волнистый, изрезанный);

• профилю – приподнятости колоний над поверхностью среды;

• размеру (точечная, мелкая, средняя, круглая).

Каждому виду бактерий свойственен определенный характер колоний, поэтому число типов определяет разнообразие видового состава бактериальной флоры исследуемого объекта.

Внешние признаки называются культуральными и используются для идентификации бактерий.

3. Из преобладающего типа выбрать изомерованную колонию, описать и зарисовать ее.

4. Выбранную колонию проверяют на чистоту путем микроскопирования в окрашенном препарате.

5. После проверки колонии на чистоту пересеять бактерии из нее на пробирку со скошенным агаром и поставить в термостат.

6. Результаты опыта записать.

Контрольные вопросы:

1. Как устанавливается чистота культуры в колонии?

2. Чем могут различаться колонии различных видов бактерий?

Занятие третье.

Определение свойств бактерий, выделенных в чистою культуру.

План занятия:

1. Описать рост бактерий на «скошенном» МПА.

2. Проверить чистоту культуры.

3. Установить морфологические признаки бактерий.

4. Сделать посев бактерий из чистой культуры на диагностические среды.

Методические указания:

1. Отметить культуральные признаки роста на «скошенном» МПА.

2. Проверка чистоты культуры на «скошенном» МПА проводится аналогично проверке чистоты колонии.

3. Для изучения морфологических признаков следует приготовить окрашенный «простым» способом препарат бактерий, определить отношение бактерий к окраске по Грамму, подвижность их установить в препарате типа «раздавленная капля».

4. Для определения видовой принадлежности бактерий надо знать физиологические признаки. Для этого надо произвести посев бактерий на различные питательные среды. Наиболее существенными физиологическими признаками являются следующие:

• Отношение к кислороду (тип дыхания). Кончиком стерильной бактериологической иглы немного бактерий внести в столбик МПА путем прокола по центру на всю длину иглы;

• Способность разжижать желатин (способность разжижать белковые вещества). Определяется аналогичным посевом бактерий в столбик МПЖ;

• Способность осахаривать крахмал. Определяется при выращивании на МПА, смешанном с крахмальным клейстером;

• Способность восстанавливать нитраты. Определяется выращиванием бактерий в пробирке МПБ с 1% KNO₃, в который опускается поплавок;

• Способность сбраживать сахара (глюкозу, сахарозу, лактозу). Определяется выращиванием на МПБ с 1% содержанием сахаров и индикатором.

• Действие на молоко. Определяется путем выращивания микроорганизмов в стерильном обезжиренном молоке.

Дополнительно к установленным культуральным признакам надо установить:

характер роста на МПБ (пленка, осадок, помутнение);

характер роста на скошенном кусочке стерильного картофеля.

Пробирки с засеянными средами (кроме МПЖ) поставить в термостат с температурой 25^оС. Чашки Петри с МПА и крахмалом поместить в термостат.

Пробирку с МПЖ оставить при комнатной температуре, т.к. желатин при 25^оС размножается.

5. Произвести запись в тетрадь.

Контрольные вопросы.

1. Какие морфологические признаки используются для определения вида бактерий?

2. Как выявить подвижность бактерий?

3. Зачем производят посевы бактерий на различные питательные среды?

Занятие четвертое.

План занятия:

1. Выявить физиологические и культуральные признаки бактерий.

2. Ознакомиться с определением вида бактерий по определителю.

Методические указания:

1. В посевах выявить и описать физиологические и культуральные признаки изучаемых бактерий.

Отношение к кислороду определить по месту развития бактерий в столбике МПА. Аэробы развиваются на поверхности столбика питательного агара, условные анаэробы – по всей длине столбика.

Способность разжижать желатин – имеют бактерии, имеющие протеолетический фермент желатиназу.

Способность осахаривать крахмал присуще бактериям, вырабатывающим амилазу (диастаз), гидролизующую крахмал. Индикатором служит раствор йода. Если крахмал осахарился, то посинение на произойдет при добавлении йода.

Способность восстанавливать нитраты – способность потреблять связанный кислород устанавливают по образованию газа N₂ при выращивании на среде с МПБ, содержащей KNO₃ и получению нитритов, определяемых с помощью добавления одной-две капли растворов серной кислоты, йодистого калия и крахмала. При наличии нитратов среда синеет.

Способность сбраживать сахара устанавливается по подкислению питательной среды (покраснение индикатора Андреде) и газообразованию (накопление газа в поплавке).

Действие на молоко проявляется по-разному

• Свертывание молока (сбраживание лактозы) и образования плотного сгустка;

• Свертывание молока (коагуляция белка бактериями) – сычужное свертывание;

• Пептонизация молока – гидролиз белков за счет протеолитических ферментов. При отсутствии пептонизации индикатором метилротом проверяют подкисление среды (розовая окраска);

• Рост на бульоне с KNO₃ (или сахарами). Отметить наличие плесени, помутнения, осадка и их характер;

• Рост на картофеле. Определить массивность налета, окраску, характер поверхности.

2. После определения морфологических, физиологических и культуральных признаков бактерий с помощью определителя установить вид бактерий.

3. Результаты опыта записать.