00 Учебное пособие по курсу биометрия

Рис 2. Схема исследования гетерогенности биообъекта на различных этапах его криоконсервирования. Сv - коэффициент вариации.

В третьей части создается математическая модель, описывающая состояние деконсервированного биообъекта в зависимости от его нативного состояния и эффективности криоконсервирования. Повышение воспроизводимости результатов обеспечивалось за счет устранения межгрупповой вариации обусловленной разным начальным состоянием биообъекта и эффективностью сопряженных этапов криоконсервирования.

6.2 Повышение воспроизводимости результатов биотехнологического исследования

Проблема проведения многофакторного биотехнологического исследования связана с низкой воспроизводимостью результатов эксперимента и, как следствие этому, несопоставимостью данных, полученных в отдельных опытах. Нами предложен алгоритм решения, включающий математическую модель и векторный способ проведения многофакторного исследования. Показано, что применение модели дает возможность многократно повысить воспроизводимость результатов за счет учета индивидуальных свойств биообъекта. Экспериментальная проверка модели на разных типах половых клеток растительного и животного происхождения показала возможность многократного сокращения количества биообъекта, взятого для эксперимента с целью получения достоверного результата. Векторный способ предоставляет возможность обеспечить проведение многофакторного анализа и его оптимизацию с графическим описанием полученных зависимостей.

Согласно векторному методу, решение задачи по оптимизации многофакторного исследования можно проводить аналитическим или графическим способом. Данный способ работает на стадии проведения поисковых опытов и практически не имеет ограничивающих условий, в отличие от существующих аналогов. Кроме того, для анализа причинно-следственных связей существует

191

возможность описания поверхности отклика. Основной особенностью предложенного метода является его применимость для биологических исследований.

Практическую применимость векторного метода рассмотрим на примере проведения исследований по криоконсервированию образцов животного и растительного происхождения.

Выраженная вариация комплекса взаимосвязанных факторов, влияющих на сохранность деконсервированного объекта, является причиной низкого уровня воспроизводимости результатов эксперимента. Поэтому оптимизация исследуемых параметров криоконсервирования биообъекта обычно проводится на различных этапах, а анализ осуществляют по результатам, полученным при одинаковых условиях проведения эксперимента.

Параметры оценки воспроизводимости жизнеспособности биообъекта: - средняя величина жизнеспособности Vср=∑V/n для определения общей дисперсии σy2;

- средняя разность жизнеспособностей в опыте и контроле ΔV=∑(Vo-Vk)/n для учета дисперсии биологических и биотехнологических факторов σi2;

- среднее отношение жизнеспособностей в опыте и контроле W=∑(Vo/Vk) для оценки дисперсии технологических факторов σi2.

Для определения силы влияния исследуемого параметра (рис. 23) применялся показатель ηi:

ηi=σi2/σy2, σy2 = ∑σi2

где: σi2 - дисперсии биологического, технологического или их совместного действия (биотехнологические факторы); σy2 - общая дисперсия.

Количество эмбрионов, необходимое для получения достоверного результата при комплексной оптимизации всей технологической цепи, можно выразить в виде произведения числа параметров, шагов их варьирования и повторов опытов (объем выборки), необходимых для получения достоверного результата в каждом эксперименте. В данном случае общий объем выборки составит от нескольких сотен до десятков тысяч эмбрионов. При учете эффекта взаимодействия факторов, число шагов варьирования исследуемого параметра будет выражаться в виде показателя степенной зависимости произведения числа параметров и количества биообъекта.

Таким образом, общепринятым критерием тестирования заданного этапа криоконсервирования биообъекта является его сохранность, полученная в результате применения данной процедуры. Однако, высокие значения вариации показателя сохранности исследуемого биообъекта и погрешности его оценки, предполагают необходимость проведения большого количества измерений для оценки эффекта взаимодействия комплекса изучаемых криобиологических параметров.

192

Случайные факторы Сv<5%

Рис 23. Схема проведения исследования воспроизводимости результатов криоконсервирования образцов животного и растительного происхождения.

Сv - коэффициент вариации всех факторов, σi2 - дисперсия факторов: i=1 не учитываемые случайные биологические (t=-2) и i=2 технологические (t=2); i=3 индивидуальные биологические свойства (t=-1); i=4 биологические и технологические в комплексе (t=0); i=5 технологические (t=1).

Очевидно, что данная задача, является практически не решаемой во всем еѐ объеме. Однако решение этой проблемы возможно по частям при наличии возможности сопоставления полученных результатов. В связи с этим возникает необходимость разработки способа оценки эффективности процесса криоконсервирования биообъекта, его этапов и составных элементов посредством использования относительных показателей, позволяющих проводить сравнительный анализ результатов исследования, полученных при различных условиях выполнения эксперимента.

Зависимости сохранности деконсервированного биообъекта - S от его начального состояния - S1 и эффективности этапов криоконсервирования - Wi представлены на рис. 26, 27. Основной причиной низкой воспроизводимости результатов опытов Сv= 0÷300% является отсутствие учета начального состояния биологического объекта S1=50÷100% и эффективности этапов криоконсервирования W2, W3 и W4 (Рис. 26).

193

Зависимость воспроизводимости результатов криобиологического эксперимента от эффективности этапов криоконсервирования:

где: G – среднеквадратическое отклонение, Cv – коэффициент вариации

(%).

Общеизвестно, что сравнивать можно только однородные величины, т. е. имеющие одинаковую размерность. Для оценки вариабельности абсолютной величины используется показатель среднеквадратического отклонения, а количественное сопоставление однородных показателей производится при помощи отношения дисперсий данных величин (дисперсионный анализ). Сравнение вариабельности разнородных величин (имеющих различные размерности) осуществляется при помощи перевода их в относительные показатели (коэффициент вариации – отношение среднеквадратического отклонения к средней величине). Поэтому для сопоставления разнородных показателей используют прием перевода их в относительную систему координат. Для описания корреляционной связи стохастических параметров применяют критерий нормированного отклонения (t - критерий Стьюдента - отношение разности средней величины и текущей к среднеквадратическому отклонению), а при оптимизации детерминистических параметров используют относительные величины.

Для сопоставимости результатов, полученных при разных условиях их реализации, используется также показатель эффективности. Термин "эффективность" означает определенный результат известных усилий. Оценка этого результата проводиться на основании количественных показателей, отражающих степень достижения намеченной цели. При этом и усилия, и результат должны быть измерены в сопоставимых единицах, а их величины подвергнуты сравнению. Эффективность выражают в процентном отношении значений полученного результата к общим усилиям. Частным случаем данного показателя является коэффициент полезного действия - отношение полезно использованной энергии к затраченной. Экономическая эффективность вычисляется как отношение прибыли к затратам.

Неучѐт начального состояния биологического материала и эффективности этапов криоконсервирования, приводит к накоплению ошибок опыта. Учет индивидуальных свойств биообъекта и особенностей этапов криоконсервирования дает возможность использовать прямые методы измерения, существенно снижающие погрешность эксперимента.

195

Снижение ошибок опытов посредством перехода от косвенных измерений к прямым:

l

Косвенные измерения i

i

Прямые измерения i

Проблема: низкая воспроизводимость результатов криобиологического исследования Сv= 60÷300%.

Следствия: отсутствие возможности сравнивать результаты, полученные при разных условиях проведения эксперимента; высокий расход биологического материала необходимого для обеспечения достоверности полученного значения; ограничения возможностей проведения многофакторного исследования.

Причины низкой воспроизводимости криобиологического исследования - неучет систематических погрешностей:

1.Начальное состояние биообъекта S1=50÷100%, Сv1= 0÷100%.

2.Эффективности этапов криоконсервирования Wi, Сvi 5%.

3.Применение общих методов статистического анализа при постановке конкретной задачи на исследование.

Задача: снизить количество используемого биообъекта посредством повышения воспроизводимости результатов криобиологического исследования на основе разработанной математической модели.

196

6.2.1. Алгоритм многофакторного анализа и оптимизации исследуемого способа криоконсервирования биообъекта

Общепринятая оценка выбранного способа криоконсервирования производится по конечному результату - сохранности объекта, который вычисляется по изменению количества объекта пригодного качества «до» и «после» замораживания. Очевидно, что на оценку сохранности деконсервированного материала оказывает влияние начальное состояние биообъекта, особенности выбранных способов применения криопротектора (для черенков растений - сушка), режим замораживания-оттаивания, способ культивирования.

Оценка эффективности выбранного способа криоконсервирования биообъекта в целом и его этапов, затруднена влиянием комплекса неучитываемых факторов. Для решения этой проблемы нами предложен алгоритм проведения исследования, объединяющий методы многофакторного анализа и оптимизации. Алгоритм построен на совместном совершенствовании выбранного способа замораживания и его модели. Модель тестируемого способа криоконсервирования биообъекта строится по результатам оценки изменения его жизнеспособности на каждом этапе проведения исследования.

Абсолютные величины и их разность дают возможность установить влияние начального состояния биообъекта на его жизнеспособность, тогда как переход к относительным величинам способствует устранению этого влияния при оценке эффективности реализации отдельных технологических операций (прил. 1). Полученные значения представляют в виде диаграммы («профиль» выбранного способа криоконсервирования биообъекта для удобства анализа слабых звеньев исследуемой технологической цепи (прил. 2)). Затем осуществляется оптимизация модели цикла криоконсервирования биообъекта предложенным векторным способом ф.(8.3÷8.5), (прил. 1, 3), (рис. 29, 30) и еѐ проверка в ходе выполнения последующего эксперимента. Совершенствование модели и способа замораживания происходит поэтапно: от оценки показателей эффективности этапов выбранного способа криоконсервирования биообъекта в процессе проведения поисковых опытов, до нахождения оптимальных значений совместно исследуемых параметров и последующим их графическим описанием.

Использование методов математического моделирования дает возможность проведения многофакторного исследования, в несколько раз повышающего его эффективность [1, 2, 11, 16, 30, 31]. При этом возможность решения поставленной задачи и условия еѐ реализации определяются в ходе проведения поисковых опытов.

Предложенный векторный способ оптимизации многофакторного исследования может выполняться как в графическом, так и в аналитическом виде. В основе векторного решения лежат два показателя: коэффициент крутизны, определяющий приоритет поиска необходимого параметра, и векторная величина k, отвечающая за направленность поиска ф. (8.2÷8.5). Графическое решение используется в случае отсутствия вычислительных средств и характеризуется удобством, простотой применения. Аналитическое решение возможно при наличии специального программного обеспечения, основанного на диалоговом режиме

197

Рис. 28. Алгоритм проведения многофакторного исследования, повышающий воспроизводимость результатов криоконсервирования спермиев и эмбрионов животных, черенков плодово-ягодных культур.

Данный способ работает на стадии выполнения поисковых опытов и практически не имеет ограничивающих условий при проведении оптимизации, в отличие от существующих аналогов. Кроме того, для изучения причинноследственных связей существует возможность графического представления зависимости относительной сохранности деконсервированного биообъекта от оптимизируемых параметров. Основной особенностью данного способа является его универсальность в применении на любой из стадий проведения исследования и, что особенно важно, – возможность выполнения дисперсионного анализа при оптимизации биологических параметров.

Сравнительный анализ показывает, что при увеличении количества совместно исследуемых факторов до пяти, потери времени и денежных средств многократно сокращаются в сравнении с традиционно применяемым однофакторным методом (прил. 2). Поиск оптимального значения и построение поверхности отклика производится в системе абсолютных величин, а обобщение параметров, имеющих разную размерность, происходит благодаря вводу относительного показателя - коэффициента «крутизны» ф. (8.2), определяющего шаг и направление изменения каждого параметра. Обобщенная векторная величина задаѐт координаты последующего измерения. Отличительная особенность предложенного способа от существующих аналогов заключается в объединении их достоинств и устранение ограничений, присущих каждому из них.

Преимущества предложенного способа заключаются в его универсальности,

198

возможности решения биологических задач; отсутствии необходимости построения регрессионных уравнений; возможности исключать параметры и вводить дополнительные; отсутствии ограничений в изменении шага и направления поиска; применимости в ходе проведения поисковых опытов; возможности использования экспериментальных данных, представленных в дискретном и непрерывном виде; одновременном проведении поиска из разных точек факторного пространства.

Основное отличие предложенного способа от существующих аналогов заключается в его применимости на этапе поисковых опытов при совместном использовании метода многофакторного анализа. При наличии программного обеспечения существует возможность (а точнее необходимость) поддержания диалога исследователя с программой. Наличие обратной связи – значимо повышает эффективность проведение исследования.

6.2.3 Определение условия решения поставленной задачи

При всем разнообразии методов исследовательской работы задача планирования эксперимента сводится к тому, чтобы при, возможно, минимальных объемах наблюдений получать достаточно полную информацию об изучаемых объектах. Установив в ходе поискового опыта основные статистические величины изучаемых явлений, такие как среднее арифметическое и среднеквадратическое отклонение, можно приступать к моделированию эксперимента. Моделирование основного эксперимента в ходе проведения поисковых опытов позволяет определить условия решения поставленной задачи и получить при завершении работы достоверный научный результат. Для определения минимального количества измерений в процессе проведения поисковых опытов для одной отдельно взятой выборки no (приложение 4 формула 3) и двух сравниваемых

(n ):

где: t - критерий Стьюдента; Сv - коэффициент вариации выборки(ок); - относительный показатель расхождения средних величин сравниваемых выборок; ∆М – расхождение значений в контроле и в опыте; М – среднее значение, полученное в контроле.

Вывод формул определения минимального количества измерений, необходимых для получения достоверного результата, представлен [11]. Если различие между выборками составляет больше семи процентов ( 7), то основной эксперимент выгодней проводить на основе сравнения с контролем. В этом случае количество биообъекта, необходимого для получения достоверного резуль-

199

тата, оказывается значимо меньше (n n), нежели при сравнении значений по отдельным средним показателям.

Использование количественного метода статистической обработки для оценки жизнеспособности эмбрионов млекопитающих даѐт возможность снизить количество измерений более чем в несколько раз по сравнению с качественным, за счет уменьшения величины коэффициента вариации выборок при условии получения достоверного результата. Поэтому там, где это возможно, более предпочтительно использовать количественный статистический анализ.

Количественный учет различного качества эмбрионов дает возможность значимо увеличить точность оценки их жизнеспособности посредством уменьшения дисперсии и тем самым понизить количество биообъекта, необходимого для получения достоверного результата. Для получения достоверных значений средних величин жизнеспособности деконсервированных эмбрионов при использовании количественного метода оценки, необходимо в 2÷5 раз меньше эмбрионов для каждой из групп, чем для качественного.

При переходе к относительным величинам коэффициент вариации снижается в 1,3÷2,6 раза, что позволяет уменьшить количество используемого биообъекта в 1,7÷6,8 раза. Полученные результаты дают подобную закономерность для суспензий клеток. Созданное программное обеспечение апробировано на эмбрионах животных (прил. 2, 3). Применение предложенного метода многофакторного исследования дает возможность сократить объем выборки в несколько раз

(прил. 2).

Повысить воспроизводимость криобиологического эксперимента возможно посредством последовательного выполнения следующих функций:

1)определение условий решения поставленной задачи – минимальное количество измерений обеспечивающих заданный уровень надежности;

2)количественная оценка состояния биообъекта – учет индивидуальных особенностей посредством усреднения разности показателей в контроле и опыте приводит к снижению вариации в 1,4÷2,4 раза;

3)оценка эффективности этапов криоконсервирования посредством усреднения отношения показателей, полученных в контроле и опыте, что снижает вариацию в 1,5÷2 раза;

4)многофакторное исследование – определение взаимосвязи варьируемых параметров, уменьшение количества опытов в 2÷10 раз;

5)сопоставимость полученных результатов при разных условиях проведения эксперимента дает возможность проведения дополнительных опытов.

Таким образом, переход от абсолютных показателей жизнеспособности биообъекта к их разности и отношению дает возможность изучать индивидуальные свойства биообъекта и осуществлять их учет при определении эффективности этапов криоконсервирования. При использовании количественного метода оценки жизнеспособности биообъекта и переходе к относительным величинам повышается точность оценки этапов криоконсервирования в полтора раза по отношению к результатам, полученным по абсолютным качественным показателям

-сохранности. Тем самым появляется возможность в несколько раз уменьшить количество биообъекта, необходимого для получения достоверного результата.

200