00 Учебное пособие по курсу биометрия

замороженных при низких (прил. 2), высоких и сверхвысоких скоростях. Проведена оптимизация концентраций криопротекторов, определяющих состав криоконсерванта в пластиковых соломинках с внешним диаметром 0,5 ÷ 2,0 мм [25] (рис. 36-39 ).

Рис. 36-39. Обобщенная эффективность криоконсервирования Wdk эмбрионов мыши в зависимости от выбора концентрации глицерина Гл и сахарозы Са при замораживании в пластиковой соломинке d=0,5 (2) мм со скоростью Bз=1680 (12 103) С/мин и отогревом B0=2520 (14,4 103) С/мин. Параметры а1 и а2 – исследуемые концентрации криопротектора (Гл и Са) ф. (8.2).

Полученная графическая зависимость эффективности криоконсервирования эмбрионов от изменения концентрации эквилибрирующего C1=15 и выводящего раствора C4=25 , вблизи его оптимального значения показывает, что ко-

172

эффициенты «крутизны» составляют 83 и 42 у.е. при замораживании эмбрионов мыши в 2 мм соломинке (рис. 36). Относительно близкие значения 83 и 26 у.е. получены при вариации концентрации глицерина и сахарозы в витрифицирующем растворе (рис. 37).

Уменьшение диаметра пластикового капилляра до 0,5 мм увеличило скорость его охлаждения в семь раз, что позволило снизить концентрацию раствора глицерина на 10 % и повысить эффективность криоконсервирования до 82 %. Сохранность девитрифицированных эмбрионов мыши увеличилась от 52 до 70 %. Эта процедура привела к увеличению силы влияния оптимизируемых параметров на эффективность криоконсервирования эмбрионов приблизительно в 1,5 ÷ 2,6 раза, в первом растворе до 95, а в четвертом до 50 у.е. (рис. 38). Для второго и третьего раствора до 170 и 116 у.е. (рис. 39) при оптимизации составляющих концентраций раствора глицерина (Гл) и сахарозы (Са), с короткой экспозицией в нем эмбрионов мыши. Уровень сохранности деконсервированных эмбрионов мыши при последующем развитии в культуре in vitro составил

70,1 6,1 %, n=54.

Таким образом, проведенное многофакторное исследование дало возможность определить оптимальные параметры криоконсервирования эмбрионов мыши при высоких и сверхвысоких скоростях замораживания. Максимальная эффективность криоконсервирования 83 % получена для скорости 11,8 103 0С/мин. Уровень сохранности деконсервированных эмбрионов мыши при последующем развитии в культуре in vitro составил 70,1 6,1 %, n=54.

5.4.3 Пример проведения оптимизации криозащитной среды и режима замораживания эмбрионов мыши, основанного на применении низких скоростей

Охлаждения эмбрионов животных реализуются посредством применения постоянных и переменных скоростей замораживания. Проведение сравнительного анализа эффективности данных способов и их этапов, на основе предложенных показателей, возможно при выполнении предварительной оптимизации параметров, определяющих жизнеспособность деконсервированного биообъекта.

Общеизвестно, что оптимальной скоростью замораживания для эмбрионов мыши и коровы является величина 0,3 0С/мин, которая обеспечивает необходимую степень обезвоживания клеток и тем самым препятствует образованию внутриклеточного льда. При этом сами клетки находятся в течение нескольких часов в гипертоническом растворе. Снизить пагубность «эффекта раствора» возможно за счѐт оптимизации характера изменения скорости замораживания посредством применения экспоненциальных режимов охлаждения.

Для определения влияния характера изменения скорости охлаждения на сохранность эмбрионов мыши проведено многофакторное исследование, направленное на установление оптимальных значений параметров: концентрации криопротектора, скорости охлаждения и величины еѐ ускорения, конечной

173

температуры охлаждения и времени выдержки биообъекта перед погружением его в жидкий азот.

Для изучения влияния изменения скорости охлаждения эмбрионов на уровень их сохранности после оттаивания разработан способ, позволяющий реализовывать разные режимы охлаждения до различных конечных температур. Получение необходимого режима охлаждения биообъекта производится на основе пассивного остывания термоблока в горловине сосуда Дьюара. Скорость охлаждения биообъекта изменяется посредством открытия поверхности термоблока, что увеличивает пропускную способность паров азота к упаковкам. Изменяя степень открытости термоблока (0 100 %) и конечную температуру охлаждения (+5 -70 0С), зависящую от глубины погружения термоблока в горловину сосуда Дьюара (3 27 см), можно реализовать требуемую величину скорости замораживания (0,1 до 15 0С/мин) эмбрионов.

Оптимизация конечной температуры охлаждения и времени выдержки эмбрионов мыши перед погружением биообъекта в жидкий азот. Для опре-

деления конечной температуры охлаждения и времени выдержки эмбрионов мыши перед погружением в жидкий азот было проведено охлаждение исследуемого биообъекта, реализованное при помощи устройства, в котором различные конечные температуры охлаждения эмбрионов получали посредством изменения глубины погружения термоблока в горловину сосуда Дьюара. В качестве криопротектора использовали 1 М раствор глицерина; биообъект был помещен в пробирки Уленгута. Величина конечной температуры охлаждения определялась при помощи полученной регрессионной зависимости.

Для определения силы влияния варьируемых параметров использовался двухфакторный дисперсионный анализ. Исследуемыми факторами являлись: конечная температура (Тк), до которой производится охлаждение биообъекта, и время выдержки эмбрионов мыши при данной температуре с последующим погружением биообъекта в жидкий азот. Уровнями градации температурной выдержки эмбрионов является -30 и -35 0С; время экспозиции составляло 0 и 15 мин (табл. 7).

По показателю сохранности выявлено достоверное влияние времени выдержки эмбрионов η2А=0,40 перед их погружением в жидкий азот и конечной температуры η2В=0,21. Совместное влияние времени выдержки и конечной температуры составило η2х=0,62, а их взаимосвязи η2АВ=0,01. Показатель жизнеспособности и эффективности дал такую же силу влияния времени выдержки η2А=0,40 и в два раза больше температуры η2В=0,45. Совместное влияние времени выдержки и конечной температуры охлаждения на жизнеспособность деконсервированных эмбрионов составило η2х=0,86. Уровень надежности полученных результатов составил Р≥0,95.

Для описания контуров эффективности криоконсервирования эмбрионов, зависящих от конечной температуры охлаждения и времени выдержки биообъекта, проведено еще четыре дополнительных опыта 5 ÷ 8 (табл. 7). Поиск оптимальных значений времени и температурной выдержки проводился в расширенной области исследования: конечная температура Тк С, до которой производит-

174

ся охлаждение биообъекта, в интервале от –25 до –37,5 С; время выдержки эмбрионов мыши при данной температуре (Тк) с последующим погружением биообъекта в жидкий азот составляло tк 0 30 мин .

Таблица 7. Определение конечной температуры охлаждения (Тк) и времени выдержки эмбрионов мыши (tk) перед погружением их в жидкий азот по показателям состояния деконсервированного биообъекта: сохранности Sdk, жизнеспособности Vdk, обобщенной эффективности криоконсервирования Wdk

Примечание:

1.n – общее количество эмбрионов мыши (отличного, хорошего и удовлетворительного качества);

2.n1 – количество пригодных эмбрионов к дальнейшему использованию, по-

лученных после оттаивания и культивирования, Sk=86,7 8,8 – сохранность (жизнеспособность Vk=81,3 6,1) нативных эмбрионов в культуре.

Для нахождения градиента роста относительной жизнеспособности деконсервированных эмбрионов проведено три опыта. В четвертом опыте найдена максимальная величина жизнеспособности деконсервированных эмбрионов. Двухфакторная оптимизация при помощи векторного метода дала возможность установить максимальную эффективность криоконсервирования эмбрионов Wdk=91 (рис.46) при конечной температуре охлаждения Тк= -32 С и времени выдержки tк=0.

Для построения поверхности отклика (контуров эффективности) использовали методы П. Берча и В. Клеймана с определенной модификацией. В отличие от предложенных аналогов экспериментальные точки в нашем случае располагались произвольным образом. При необходимости построения полной картины

175

поверхности отклика, методом линейной экстраполяции находили расчетные точки на продолжениях линейных отрезков (на расстояниях, равных длинам предшествующих отрезков). Соседние точки соединяли линейными отрезками и методом линейной интерполяции определяли расчетные значения функции отклика (величины эффективности) в серединах этих отрезков. Пунктирными линиями соединяли точки, имеющие одинаковые значения показателей эффективности.

Рис. 46. Эффективность криоконсервирования (Wdk) эмбрионов мыши в зависимости от выбора конечной температуры охлаждения (Тк) и времени выдержки (tk) перед погружением биообъекта в жидкий азот. Номер, очерченный кругом, отражает показатель эффективности, а треугольником - величину «крутизны» подъема вектора ф (8.4). Пунктирной линией обозначены контуры эффективности криоконсервирования, имеющие одинаковые величины.

Параметры а3 и а4 - исследуемые величины (Тк и tk), представленные в относительной форме ф (8.2).

Анализ контуров обобщенной эффективности криоконсервирования эмбрионов показывает, что оптимизируемые параметры (время выдержки и конечная температура) оказывают значимое влияние на сохранность биообъекта. Коэффициент «крутизны», отражающий изменение относительной жизнеспособность биообъекта и рассчитанный для конечной температуры охлаждения, изменяется от 10 до 53 у.е, а для времени выдержки перед его погружением в жидкий азот - 22 ÷ 46 у.е в зависимости от области факторного пространства, для которого он был рассчитан. Рассчитанные выше показатели силы влияния, выраженные в процентах, дают сопоставимые величины 40 и 45 %. Вместе с тем в области оптимума вариация времени выдержки эмбрионов оказывает более значимое влияние чем температура, коэффициенты «крутизны» которых составляют 45 и 10 у.е. соответственно. Следует обратить внимание на то, что конечная температура охлаждения биообъекта и время его выдержки перед по-

176

гружением в жидкий азот также зависят от режима охлаждения, то есть величины скорости и характера еѐ изменения.

Применение векторного способа оптимизации конечной температуры охлаждения и времени выдержки эмбрионов мыши перед их погружением в жидкий азот по пяти уровням градации дало возможность описать зависимость изменения сохранности эмбрионов мыши и эффективности их криоконсервирования по 8 проведенных опытах в сравнении с 25 необходимыми для традиционно используемого способа латинского квадрата.

Таким образом, проведенная двухфакторная оптимизация дала возможность сократить количество опытов в 3,1 раза при определении максимальной эффективности криоконсервирования эмбрионов мыши Wdk=91 , соответствующей конечной температуре охлаждения Тк=-32 С и отсутствии временной выдержки биообъекта перед его погружением в жидкий азот.

Изучение влияния характера изменения скорости охлаждения на со-

хранность эмбрионов мыши. Для получения различных экспоненциальных режимов охлаждения эмбрионов мыши применялся способ «помещение биообъекта в уже охлажденный термоблок». Для этого контейнеры с биообъектом (5) и

(6) размещали в предварительно охлажденном термоблоке в отверстия, которые расположены в диске (4). Для получения необходимой конечной температуры охлаждения термоблока (3) его располагали на глубине L =11,5см от верхнего края горловины сосуда Дьюара. Предварительное охлаждения термоблока длилось от 0 до 60 минут, что определяло скорость охлаждения контейнера содержащего биообъект.

Для определения оптимального режима замораживания термоблок погружали на заданную глубину с целью достижения конечной температуры охлаждения биообъекта -30 2 0С, при этом время предварительного охлаждения блока составляло от 0 до 60 мин. После охлаждения термоблока в него помещали пробирку Уленгута или соломинку, выдерживая в течение 120 мин для обезвоживания клеток. После выхода режима на заданную (конечную) температуру охлаждения, контейнеры, содержащие эмбрионы, переносили в жидкий азот.

__

Величина средневзвешенной скорости охлаждения ( B , 0С/мин) соломинок и пробирок Уленгута в диапазоне от -5 до -25 0С имела разные значения (В, 0С/мин), а от -5 до -30 0С составляла 0,3 0С/мин (табл. 8, рис. 47).

Для описания полученных режимов охлаждения термоблока использовалось регрессионное выражение:

где: T – температура, С; t – время выдержки термоблока; a0, a1 – коэффициенты регрессионного уравнения.

Для удобства обозначения каждого режима ему присвоен номер в соответствии длительности предварительного охлаждения термоблока:

177

Таблица 8. Зависимость скорости замораживания (В, 0С/мин) от времени предварительного охлаждения термоблока (tп.о., мин)

Рис. 47 Режимы охлаждения эмбрионов млекопитающих в горловине сосуда Дьюара: 0 - контролируемое программное замораживание с постоянной скоростью 0,3 0С/мин; 1 - режим замораживания без предварительного охлаждения термоблока; 3 - в предварительно охлажденном термоблоке в течение 20 минут; 4 - в предварительно охлажденном термоблоке в течение 40 минут.

Для повышения сохранности деконсервированных эмбрионов мыши, исследовалось совместное действие изменения концентрации криопротектора и режима замораживания. Концентрацию криопротектора изменяли в диапазоне от 5 до 15 глицерина. В качестве тестируемых режимов апробировано несколько вариантов охлаждения эмбрионов мыши: с постоянной скоростью B=0,3 С/мин, полученной при помощи программного замораживателя ЗЭМ-3 – N=0 54 ; переменной, основанной на пассивном охлаждении термоблока 100 в горловине сосуда Дьюара ф (2) – N=1; замораживание эмбрионов в термоблоке, предварительно охлажденном в горловине сосуда в течение 10 мин ф. (3) – N=2; с пред-

178

варительным охлаждением термоблока в течение 20 мин ф. (4) – N=3; с охла-

ждением 40 мин ф. (5) – N=4; 60 мин – N=5 ф. (6).

На первом этапе исследования для определения силы влияния варьируемых параметров использовался двухфакторный дисперсионный анализ с двумя уровнями градации (опыты 1 ÷ 4 табл. 9). По показателю сохранности выявлено существенное влияние режима замораживания эмбрионов η2А=0,67 и незначительное по концентрации криопротектора η2В=0,09. Совместное влияние режима замораживания и концентрации криопротектора составило силу влияния η2х=0,76, а их взаимосвязь η2АВ=0,01.

Таблица 9. Выбор экспоненциального режима замораживания и концентрации криопротектора в комплексе по показателям состояния деконсервированного биообъекта: сохранности Sdk, жизнеспособности Vdk, обобщенной эффективности криоконсервирования Wdk

Примечание:

1.C1 - концентрация криопротектора с длительной экспозицией (t =10 мин,

T=20 2 С);

2.n – общее количество эмбрионов мыши (отличного, хорошего и удовлетворительного качества);

3.n1 – количество пригодных эмбрионов. Сохранность нативных эмбрионов

вкультуре – Sk=86,7 8,8;

4.Конечная температура охлаждения биообъекта составляет Тк=-32 С и время выдержки tk=0.

179

Показатели жизнеспособности и эффективности дали большее значение влияния режима замораживания η2А=0,77 и η2А=0,71 соответственно. Сила влияния фактора, отвечающего за концентрацию криопротектора, составила η2В=0,09 и η2В=0,18. Совместное влияние режима замораживания и концентрации криопротектора составило силу влияния η2х=0,86 и η2х=0,89 соответственно. Уровень надежности полученных результатов составляет Р≥0,95.

Следует отметить, что при использовании показателей сохранности и жизнеспособности биообъекта, влияние концентрации криопротектора на биообъект

– 9 %, а эффективности 18 %. Поиск оптимальных значений, определяющих концентрацию криопротектора и режим замораживания, производился на основе применения векторного метода при помощи дополнительно проведенных опытов 5 ÷ 9 (табл. 9). Совместная оптимизация концентрации криопротектора и режима замораживания показала, что максимальная жизнеспособность эмбрионов после оттаивания получена при использовании 10 раствора глицерина для режимов N 1 и N 2. При использовании скорости охлаждения 0,3 ÷ 0,6 0С/мин в температурном диапазоне от -5 до -25 0С получена жизнеспособность (эффективность криоконсервирования) эмбрионов мыши 78 ÷ 80 % (88 ÷ 93 %). При увеличении скорости от 0,8 до 3,3 0С/мин показатели жизнеспособности снизи-

лись от 75 (76 %) до 57 % (63 %) (рис. 48).

Рис. 48 Обобщенная эффективность криоконсервирования (Wdk) эмбрионов мыши в зависимости от концентрации глицерина (Гл) и выбора режима замораживания (N). Конечная температура охлаждения биообъекта составляет Тк=-32 С и время выдержки tk=0. Параметры а1 и а2 - исследуемые параметры (С и N) представленные в относительной форме ф. (8.2).

180