Kwas askorbinowy
3.1. Biogeneza I budowa
Kwas L-askorbinowy (L-AA, witamina C) jest jedną z najbardziej znanych witamin o wielokierunkowym działaniu. Nazwa – kwas askorbinowy – pochodzi od choroby, którą wywołuje jego niedobór (szkorbut – łac. scorbutus).[13] Kwas L-askorbinowy przedstawia się wzorem sumarycznym C5H8O6, wzór półstrukturalny ustalono w 1933 r. (Rys. 3.). Centrum cząsteczki stanowi czterowęglowy pierścień γ-laktonowy, którego rozerwanie prowadzi do rozpadu kwasu L-askorbinowego na kwas szczawiowy i kwas L-treonowy. Witamina C jest silnym reduktorem z powodu ugrupowania endiolowego pomiędzy C2 i C3, które chętnie oddaje protony i elektrony, stając się ugrupowaniem diketonowym kwasu dehydroaskorbinowego.
R
ys.
3. Wzór półstrukturalny kwasu L-askorbinowego.[14]
Biosynteza witaminy C w formie kwasu L-askorbinowego może odbywać się w wątrobie większości zwierząt dzięki obecności enzymu oksydazy L-glukono-γ-laktonowej. Rośliny również maja zdolność do syntezy tego kwasu przy pomocy dehydrogenazy galaktono-laktonowej. Natomiast nie jest możliwa jego synteza w organizmie ludzkim, dlatego człowiek musi dostarczać witaminę C z pożywieniem. Związek ten jest pochodną sacharydów. W organizmie zwierząt powstaje z D-glukozy. U roślin występują dwa szlaki metaboliczne, którego produktem jest kwas L-askorbinowy. Może on powstawać zarówno z D-glukozy jak i D-galaktozy.
3.2. Synteza do celów przemysłowych
Z powodu dużego zapotrzebowania na witaminę C konieczne było opracowanie metody przemysłowych otrzymywania jej. Od ponad 60 lat główną metodą produkcji była 7-etapowa metoda chemiczno-mikrobiologiczna Reichsteina (Rys. 4.). W pierwszym etapie przy pomocy szczepu Gluconobacter oxydans następuje utlenienie D-sorbitolu do L-sorbozy przy pH 4-6 i temperaturze 30°C. W dalszych etapach, po redukcji L-sorbozy, następuje organiczne utlenianie za pomocą nadmanganianu potasu i ogrzewanie z wodą, w wyniku czego powstaje kwas 2-keto-L-gulonowy. Ostatnim etapem jest zamykanie pierścienia z usunięciem wody. Można otrzymać również kwas 2-keto-L-gulonowy bezpośrednio z L-sorbozy przy pomocy platyny i tlenu. Metoda ta wymaga użycia agresywnych rozpuszczalników, wysokiego ciśnienia i temperatury, co skutkuje podwyższeniem kosztów produkcji szczególnie przy coraz bardziej zaostrzających się przepisach bezpieczeństwa. Dąży się więc do optymalizacji tej metody przy pomocy mieszanin różnych kultur bakteryjnych i ich genetycznej modyfikacji szczepów. W przeprowadzonych badaniach naukowcy (Sugisawa, Miyazaki, Soshino 1990) dokonali konwersji 92% L-sorbozy z udziałem zmodyfikowanych promieniowaniem UV szczepów Gluconobacter oxydans i Bacillus megaterium. W kolejnych fazach uzyskano kwas 2-keto-L-gulonowy, będący produktem pośrednim w reakcji syntezy kwasu L-askorbinowego, z D-sorbitolu i L-sorbozy z wydajnością odpowiednio 50 i 60%. W tej fazie zastosowano szczmy G. melanogenus.[15]
Rys. 4. Przemysłowa produkcja kwasu L-askorbinowego poprzez syntezę Reichsteina z udziałem jednoetapowej fermentacji przez szczep Gluconobacter oxydans. 1 – D-glukoza; 2 – D-sorbitol; 3 – L-sorboza; 4 – Diacetono-L-sorboza; 5 – kwas 2-keto-L-gulonowy; 6 – kwas L-askorbinowy.[16]
Innymi mikroorganizmami, które mają zdolność syntezy analogu witaminy C, są drożdże. Produkują one kwas D-erytroaskorbinowy (D-EAA). Ma on podobne właściwości antyoksydacyjne, ale nie zapobiega powstawaniu szkorbutu. Naukowców zainteresowało to, że dwa etapy biosyntezy D-EAA przez drożdże i analogiczna sekwencja zachodząca w roślinach przy biosyntezie L-AA wykazują duże podobieństwo. ,,Okazuje się że zaangażowana w proces biosyntezy oksydaza D-arabinono-1,4-laktonu, izolowana z Candida albicans i Saccharomyces cerevisiae, akceptuje in vitro, oprócz naturalnego (D-arabinozy), również takie substraty, jak L-galakto-1,4-lakton oraz L-gulono-1,4- lakton, pozwalając na produkcję L-AA w komórkach.''[17] Akumulacja kwasu L-askorbinowego w komórkach po inkubacji z L-galaktozą zapewnia dehydrogenaza D-arabinozy.[18] Elastyczność tych ścieżek znalazła zastosowanie w jednoetapowym procesie fermentacji przy udziale udoskonalonych szczepów S. cervesiae i Zygosachoromyces bailii.[19] Problemem w wykorzystaniu do syntezy przemysłowej drożdży staje się jednak wysoki koszt L-galaktozy. Rozwiązaniem wydaje się być opracowanie metody otrzymywania jej przez zrekombinowane szczepy bakteryjne z tańszych substratów.
Jednoetapowy proces fermentacji opracowano również w 1996 r. przy użyciu heterotroficznych mikroalg Chlorella pyrenoidosa, które deponują witaminę C wewnątrz swoich komórek. Proces objął produkcję biomasy do wykorzystania w przemyśle paszowym i farmaceutycznym. Po zoptymalizowaniu warunków hodowli i odpowiedniej modyfikacji szczepów uzyskano 70-krotny wzrost wydajności w stosunku do szczepu pierwotnego.[20]