3. Причины нелинейности кривых связывания, коэффициент кооперативности Хилла

Рассмотрение различных координат для анализа кривых связывания вызывает закономерный вопрос о преимуществах и недостатках каждого из вышеупомянутых методов. Популярность координат Скэтчарда по сравнению с двойными обратными координатами обусловлена тем обстоятельством, что в координатах Скэтчарда контрастнее выявлялись нелинейности связывания. Любое отклонение графика в координатах Скэтчарда от прямой линии означает, что лиганд-рецепторное взаимодействие идет по схеме посложнее, чем «один лиганд - один некооперативный рецептор». В обратных координатах эти нелинейности не так заметны.

Вид кривых связывания в координатах Скэтчарда для различных моделей лиганд-рецепторного взаимодействия: один лиганд – один некооперативный центр (____), положительная кооперативность связывая (……), наличие двух типов связывания или отрицательная кооперативность (- - - - -).

Наличие нелинейности на кривых связывания объясняется двумя основными причинами:

1) гетерогенностью связывания т. е. наличием двух или более типов связывания, различающихся по значению констант связывания;

2) кооперативностью связывания т.е. изменением константы связывания идентичных центров по мере присоединения к ним лигандов.

В случае гетерогенного связывания концентрация связанного лиганда r, определяется как аддитивная сумма молекул лиганда, связанных с различными участками:

Гетерогенность связывания наиболее отчётливо проявляется в координатахБьеррума.	Для анализа кооперативности связывания обычно используют координаты Хилла. Предложил модель связывания О2 с Hb, объясняющую s-образный (сигмоидный?) характер кривой связывания
При различии констант диссоциации в уже 5-10 раз на кривой появляются характерные перегибы. Типичным примером таких кривых являются кривые потенциометрического титрования многоосновных кислот (Пр: лимонная кислота ).	Согласно модели Хилла, центры связывания О2 на молекуле Hb не являются независимыми и присоединение первого лиганда увеличивает сродство остальных центров настолько, что они заполняются практически мгновенно. Это предположение эквивалентно тому, что в любой равновесной смеси лиганда (L) и макромолекул, имеющих n идентичных центров связывания, присутствуют в значительных концентрациях либо только макромолекулы с незанятыми центрами связывания (М), либо комплексы лиганда с макромолекулой (MLn), где все центры заполнены. Для реакции практически одновременного присоединения n лигандов M + nL ↔MLn константа связывания (Kh) определяется выражением: [MLn] - концентрация комплексов, c – свободного лиганда, [M] – центров связывания.
	Полагая концентрацию участков связывания равной N, а степень их заполнения равной y, выразим [MLn] и [M] через оные параметры: концентрация заполненных центров связывания [MLn]=yN, а незаполненных [M]=(1-y)N. Тогда уравнение можно представить как Прологарифмируем: – уравнение Хилла

Применение координат Хилла позволяет охарактеризовать степень кооперативности связывания по наклону экспериментальных прямых, который обозначают h и называют коэффициентом Хилла.

* далее идёт куча текста про коэффициент. Не знаю, надо - не надо

Уравнение Хилла удовлетворительно описывает кооперативное связывание экспериментально получаемых кривых в интервале от 10 до 90 % насыщения (прямолинейный участок кривых связывания в координатах Хилла).

Коэффициент Хилла удобно использовать в качестве простой меры, определяющей характер и степень кооперативности. Если h = 1, то кооперативность отсутствует, как это проявляется, например, в случае миоглобина, представляющего собой по сути отдельные субъединицы гемоглобина. При h<1 кооперативность связывания отрицательная, т. е. происходит уменьшение сродства при последовательном связываниии лигандов. При h>1 имеет место положительная кооперативность, т. е. усиление сродства по мере связывания лигандов.

	График Хилла для насыщения гемоглобина лошади кислородом (h=2,9). P – парциальное давление кислорода (относительные единицы), пропорциональное его концентрации.
	В модели Шанжа-Уаймена-Моно предположены два состояния молекулы гемоглобина: 1) напряжённую - taut (T); 2) гибкую - relaxed (R). Между этими состояниями существует равновесие. В R состоянии сродство к лиганду намного выше, чем в Т состоянии, поэтому связывание лиганда увеличивает вероятность перехода в R состояние .

4. Для количественного описания температурных эффектов в химической кинетике для приближённых вычислений используют правило Вант-Гофф: повышение температуры на 10 К удваивает скорость реакции.

Математически это означает, что скорость реакции зависит от температуры степенным образом

где gamma — температурный коэффициент скорости (его значение лежит в интервале от 2 до 4).

Правило Вант-Гоффа является весьма грубым и применимо только

в очень ограниченном интервале температур.

Часто используют температурный коэффициент Q₁₀ Вант-Гоффа, показывающий во сколько раз ускоряется процесс при повышении температуры на 10^о С: Q₁₀ = (v_T+10)/(v_T), где скорость процесса или величина какого-либо физико-химического показателя процесса

при температуре Т; v_T+10 ─ то же самое при температуре Т+10^о.

Температурный коэффициент зависит от природы протекающих реакций.

Для физических процессов он немногим отличается от единицы:

для диффузии ─ 1,1÷1,2, для электропроводности ─ 1,2÷1,3.

Для ферментативных процессов Q₁₀ имеет величину около 1,7,

а для химических процессов ─ 2÷4.

Так, А.Ф. Самойлов установил, что процесс возбуждения в нерве имеет

Q₁₀ = 1,7, что характерно для ферментативных реакций. А для проведения возбуждения от концевых пластинок нерва к мышце получен коэффициент

2,5÷2,7, характерный для химических процессов.

Гемолиз эритроцитов активных форм витамина D также имел Q₁₀ = 1,7,

что позволило предполагать ведущую роль фосфолипаз в этом процессе.

Гемолиз, вызванный асбестовыми пылями, имел коэффициент Q₁₀ = 1,1, что свидетельствует о физических механизмах гемолиза.

5.

Вещества, имеющие в структуре как полярные, так и неполярные группы,

называются амфифильными. К этой группе принадлежат, например, жиры,

Фосфолипиды и желчные кислоты. при контакте с водой склонны образовывать структуры, у которых площадь контакта неполярной части молекул с водой минимальна.

На поверхности воды такие вещества обычно образуют монослойные пленки, у которых полярные группы ориентированы в воду. В воде амфифилы образуют протяженные бислойные мембраны или мицеллы, у которых полярные группы ориентированы в воду. По этому принципу построено большинство биоструктур: белков, мембран и ДНК.

Обозначим площадь поверхности гидрофобного ядра через S

(S = 4πr² , где r – радиус гидрофобного ядра).

Тогда объём гидрофобного ядра будет равен V_i = Sr/3, а объём гидрофильной фазы приближенно равен V_e = Sd. Соответствующее отношение объёмов фаз в случае сферической глобулы (b_s) равно:

b_s = V_e/ V_i = 3Sd/Sr = 3d/r = 3d/ (r₀ – d)

при b = b_s→ сферическая глобула, b>b_s→ эллипсоид или фибрилла,

b<b_s→ агрегация белков.

С позиций современной патологии важно отметить, что «мутное набухание» отразило два феномена повреждения клетки:

1. денатурационное изменение белков (мутность);

2. набухание – нарушение водного баланса клеток т.е. фактически нарушение функционирования мембран.

Может ли денатурированный белок ренатурировать и обрести свою нативную структуру? То есть  —  обратима ли его денатурация?

       Да (это известно со времен опытов Анфинсена в 60-х гг.;),  —  если белок не слишком велик и не подвергался сильной химической модификации после сворачивания invivo: тогда "мягко" (без разрыва цепи) разрушенная температурой, денатурантом и т.д.  —  архитектура белка спонтанно восстанавливается при "нормализации" среды. Правда, эффективная ренатурацияinvitroнуждается в тщательном подборе экспериментальных условий  —  иначе ей может воспрепятствовать выпадение из раствора и/или агрегация

6.

Шаперо́ны — класс белков, главная функция которых состоит в восстановлении правильной третичной структуры повреждённых белков, а также образование и диссоциация белковых комплексов. Термин «молекулярный шаперон» впервые был использован в работе Ласкей и других при описании ядро клетка ядерного белка нуклеоплазмина предотвращать агрегирование белков-гистонов с ДНК при образовании нуклеосом.

Шапероны есть во всех живых организмах, и механизм их действия, нековалентное присоединение к белкам и их «расплетение» с использованием энергии гидролиза АТФ также консервативен.

1 – Сходящая с рибосомы полипептидная цепь, связанная с шаперонамиhsp 70 цитоплазмы;

2 - шапероныhsp 70 экранируют гидрофобные области полипептида, предотвращая его агрегацию;

3 – белки, сворачивающиеся в цитоплазме, передаются с шаперонаhsp 70

на цитоплазматический шаперонин, где и происходит сворачивание;

4 – белки, сворачивающиеся в митохондрии: цитоплазматическмйшаперонhsp 70 “подносит” развёрнутый белок к внешней мембране митохондрий, при этом митохондриальныйшаперонhsp 70, прочно связываясь с пересекающим мембрану белком, способствует его “втягиванию” внутрь митохондрии,

а затем передаёт его на митохондриальныйшаперонин, где и происходит сворачивание;

5 – белки, сворачивающиеся в эндоплазматическом ретикулуме

HSP60, данный шаперон по своей структуре напоминает плод малины, состоящий из множества субъединиц. Его внутренняя полость высокогидрофобна и «втягивает» в себя гидрофобные аминокислоты еще не полностью свернувшейся белковой молекулы, заставляя последнюю изменить конфигурацию. Такой процесс может иметь многоступенчатый характер, полость многократно захватывает и отпускает белковую молекулу, оптимизируя ее форму. Благодаря своей способности укладывать правильным образом белковые глобулы шаперон HSP60 получил название фолдазы (от англ. tofold — «укладывать, сворачивать»). Белок HSP100 напротив называют антифолдазой (от tounfold — «разворачивать»). Он тоже имеет субъединичную структуру, и в сотрудничестве с шапероном HSP70 демонтирует белки, получившие необратимые повреждения, разрушает ошибочно образовавшиеся агрегаты и даже заставляет развернуться полностью упаковавшуюся молекулу.

Участие шаперонов-70 в предотвращении гидрофобных взаимодействий между участками синтезирующегося полипептида; Б - формирование нативнойконформации белка в шапероновом комплексе.

Многие высокомолекулярные белки, имеющие сложную конформацию, например доменное строение, осуществляют фолдинг в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц. Они формируют два полых кольца, каждое из которых состоит из семи субъединиц, эти кольца соединены друг с другом. Каждая субъединица Ш-60 состоит из трех доменов: апикального (верхушечного), обогащенного гидрофобными радикалами, обращенными в полость кольца, промежуточного и экваториального.

При нарушении функции шаперонов и отсутствии фолдинга в клетке формируются белковые отложения – развивается амилоидоз. Амилоид представляет собой гликопротеид, основным компонентом которого являются фибриллярные белки. Они образуют фибриллы, имеющие характерную улырамикроскопическую структуру. Фибриллярные белки амилоида неоднородны. Насчитывают около 15 вариантов амилоидоза.

7. История изучения и современные представления о строении биологических мембран.

Термин "мембраны" как окружающей клетку невидимой плёнки, служащей барьером между содержимым клетки и внешней средой и одновременно - полупроницаемой перегородкой, через которую могут проходить вода и некоторые растворенные в ней вещества, был впервые использован фон Молем и независимо К. фон Негели в 1855 г для объясненеия явлений плазмолиза. В 1877 г. В. Пфефферопубликовал свой труд“Исследования осмоса” где постулировал существование клеточных мембран, основываясь на сходстве между клетками и осмометрами, имеющими искусственные полупроницаемые мембраны.Изучение осмотических явлений в растительных клетках Х. де Фризом послужило фундаментом при создании физико-химических теорий осмотического давления и электролитической диссоциации Я. Вант-Гоффом и ученым С. Аррениусом . В 1888 году В. Нернст вывел уравнение диффузионного потенциала. В 1890 году В. Оствальд измерил проницаемость клеточной мембраны для большого числа соединений и показал прямую зависимость между способностью этих соединений проникать через мембраны и их растворимостью в липидах.В 1902 году Ю. Бернштейн (1839-1917) привлек для объяснения электрических свойств живых клеток мембранную гипотезу. В 1925 году Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов, экспериментально доказали что биологическая мембрана содержит в своем составе и белковые молекулы. Первой моделью биомембранДаниэли-Давсона (1935), которую часто называют моделью «сэндвича», в котором слой масла (липиды мембран) находится между кусками хлеба (белки). 1975 г. в модель были добавлены водные поры, чтобы объяснить проницаемость мембран для воды.

8.фунции мембран

Функции мембран:

1. Барьерная- отделяющего клетку от окружающей среды, и разделяющего внутренний объем клетки на сравнительно изолированные "отсеки"

2. Матриксная-расположение в определенном порядке белки и белковые ансамбли, образующие системы переноса электронов, запасания энергии в форме АТФ, регуляции внутриклеточных процессов гормонами и тд

3. Регуляция транспорта- Активный транспорт ионов K+, Na+, Ca2+, подержание осмотического равновесия( для клеточной мембраны) перенос электронов на кислород и синтез АТФ (окислительное фосфорилирование)(- для внутренней мембраны митохондрий ) . Перенос ионов кальция из клеточного сока внутрь везикул( -для эндоплазматического ретикулума)

4. Восприятие сигналов-Генерация потенциалов покоя и действия, распространение потенциала действия( для клеточной мембраны )

5. Межклеточные взаимодействия - Контактное взаимодействие с межклеточным матриксом и взаимодействие с другими клетками при слиянии клеток и образовании тканей.

ЧЕТЫРЕ ПРИЧИНЫ НАРУШЕНИЯ БАРЬЕРНЫХ СВОЙСТВ МЕМБРАН В ПАТОЛОГИИ:

1.Перекисное окисление липидов.2Действие мембранных фосфолипаз.3Механическое (осмотическое) растяжение мембраны.4Адсорбция на липидном слое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды

9. Монослои как модель биологической мембраны. БЛМ как модель биологической мембраны.

Модели мембран-1монослойные 2-бислойные а) плоские (блм) б) сферические- однослойные и многослойные 3-полислойные

Модель  монослой липидов на границе раздела вода — воздух или вода — масло. На таких границах молекулы липидов расположены так, что гидрофильные головки находятся в воде, а гидрофобные хвосты — в воздухе или в масле.Если постепенно уменьшать площадь, занимаемую монослоем, в конце концов удастся получить монослой, в котором молекулы расположены так же плотно, как и в одном из монослоев мембраны. При изменении состояния липидных молекул (под действием температуры, взаимодействия липидов с различными лекарственными препа­ратами и пр.) меняется площадь, занимаемая молекулами. Поэтому в биологических и медицинских исследованиях широко используются монослои синтетических липидов, изолированных из различных природных мембран

Стадии приготовления БЛМ.

Для изучения ионной проницаемости липидного слоя мембран используют БЛМ.

Для приготовления БЛМ в стаканчик с раствором электролита помещают второй, тефлоновый стаканчик , в стенку которого сделано отверстие, диаметром около 1 мм.

С помощью капилляра в отверстие вводят маленькую каплю раствора фосфолипида в жидком углеводороде, гептане или гексане.Молекулы фосфолипидов собираются на поверхности капли таким образом, что полярные головки молекул обращены в водную среду, а гидрофобные хвосты

- внутрь капли .Постепенно растворитель уходит из капли и улетучивается, а капля превращается в липидную пленку (БЛМ)