1) Ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию угле­водов с образованием органических кислот;

окисление — полное расщепление органического суб­страта до СОг и НгО;

ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота;

диссимиляцию (деградацию) субстрата;

гидролиз субстрата.

Классический (традиционный) метод идентификации мик­робов по биохимическим признакам заключается в посеве чис­той культуры на дифференциально-диагностические среды, со­держащие определенные субстраты, с целью оценки способ­ности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследова­ние занимает не менее 1 сут. Примером является оценка сахаролитической активности бактерий (способности ферментиро­вать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный "пестрый ряд".

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда". Корот­кий "пестрый ряд" включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный "пестрый ряд" наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнооб­разными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галак­тоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органи­ческих кислот), и "поплавок" для обнаружения выделения

Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают пет­лей в среды "пестрого ряда". Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, на­блюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистриру­ется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом".

Для определения протеалитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 *С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, на­поминающую воронку или елочку.

В посевах в пептонную воду определяют продукты расщеп­ления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 "С путем постановки реакций на аммиак, индол, серово­дород и др.

Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бу­маги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с куль­турой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энер­гично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблю­дается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо .

Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении серо­водорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), ок­рашивающий бумагу в черный цвет. Продукцию HjS можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления fyS (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло нано­сят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий ката­лазы.В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их иденти­фикации. При необходимости исследуют другие признаки, на­пример способность к восстановлению нитратов, карбоксилированию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов.

Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют.

45)определение способности ферментирования белка

В бактериологии для дифференциации микроорганизмов по биохимическим свойствам основное значение часто имеют конечные продукты и результаты действия ферментов. В соответствии с этим существует микробиологическая (рабочая) классификация ферментов.

1. Сахаролитические.

2. Протеолитические.

3. Аутолитические.

4. Окислительно- восстановительные.

5. Ферменты патогенности (вирулентности).

Ферментный состав клетки определяется геномом и является достаточно постоянным признаком. Знание биохимических свойств микроорганизмов позволяет идентифицировать их по набору ферментов. Основные продукты ферментирования углеводов и белков- кислота, газ, индол, сероводород, хотя реальный спектр для различных микроорганизмов намного более обширный.

Основные ферменты вирулентности- гиалуронидаза, плазмокоагулаза, лецитиназа, нейраминидаза, ДНК-аза. Определение ферментов патогенности имеет значение при идентификации ряда микроорганизмов и выявления их роли в патологии.

Ряд ферментов микроорганизмов широко используется в медицине и биологии для получения различных веществ (аутолитические, протеолитические), в генной инженерии (рестриктазы, лигазы).

46) определение выработку индола и сероводорода. Для определœения продукции бактериальной культурой индола применяется способ Мореля. Культуру засевают в мясопептонный бульон или пептонную воду (лучше с добавлением триптофана, при утилизации которого выделяется значительное количество этого газа) и под пробку помещают фильтровальную бумагу, пропитанную щавелœевой кислотой.

а. При продукции бактериальной культурой индола нижняя часть бумажки краснеет.

б. В случае если культура не продуцирует индол – бумажка остается бесцветной.

2. Более надежен способ Эрлиха. В пробирку с изучаемой культурой добавляют специальный реактив.

2. Более надежен способ Эрлиха. В пробирку с изучаемой культурой добавляют специальный реактив.

а. В присутствии индола реактив краснеет.

б. В случае если индола нет – реактив остается бесцветным.

в. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) аммиак. Для выявления этого признака под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают лакмусовую бумагу так, чтобы она не касалась поверхности среды.

1. При образовании аммиака лакмусовая бумажка синœеет.

2. В случае если аммиак не образовывается, лакмусовая бумажка цвет не изменяет.

ᴦ. У микробов, обладающих протеолитической активностью, при утилизации белкового субстрата может образовываться (или не образовываться) сероводород.

1. С этой целью под пробку пробирки с засеянной питательной средой помещают фильтровальную бумагу, пропитанную ацетатом свинца.

а. При продукции бактериальной культурой сероводорода нижняя часть бумажки чернеет.

б. В случае если культура не продуцирует сероводород – бумажка остается бесцветной.

47)Процесс аэробного дыхания является более сложным, так как в нем принимают участие разные ферменты типа дегидраз и окси - даз. Аэробные микроорганизмы также очень разнообразны, по­этому и типов аэробного дыхания много, причем отличаются они друг от друга ферментами, участвующими в окислении субстра­та. У микроорганизмов, имеющих окислительные ферменты — пе - роксидазу и каталазу, механизм аэробного дыхания сравнительно прост: водород, катализуемый дегидразой, передается кисло­роду, при этом образуется перекись водорода, которая далее при помощи фермента пероксидазы направляется на окисление спе­цифического субстрата или расщепляется каталазой до молеку­лярного кислорода и воды, освобождая тем клетку от накопления этого ядовитого вещества. Согласно теории Варбурга решающим условием окисления является активирование кислорода при по­мощи железа, входящего в состав дыхательного фермента. В про­топлазме аэробных микроорганизмов есть' и другие группы ферментов — переносчиков кислорода, например, окислительный «желтый дыхательный фермент», который легко восстанавливает­ся, присоединяя активированный водород субстрата при помощи дегидраз, а затем вновь окисляется, отдавая водород молекуляр­ному кислороду. При этом образуется перекись водорода.

48)признаки произведения идентификаций чистой культуры микроба

Термин «идентификация» в переводе с латинского «identifico» обозначает отождествление. То есть, речь идет об установлении видовой и вариантной принадлежности микроорганизмов, выделяемых из окружающей среды. Это определение таксономической принадлежности осуществляется путем сопоставления основных, выявленных исследователем признаков у выделенных культур (классификационными признаками микробов, описанных в литературе или определителях). Схема такова: исследователь выделяет микроб в «чистой культуре» - изучает основные характеристики культуры - сопоставляет выявленные признаки с известными таксономическими группами.

Следовательно, идентификация микроба - это заключительный этап любого микробиологического исследования с целью обнаружения микроорганизмов в объектах внешней среды или лабораторной диагностики инфекционной болезни.

Первым шагом идентификации является получение микробов в чистой культуре. В зависимости от изучаемого микроорганизма методы получения чистых культур варьирует от повторных рассевов в чашках Петри на средах общего назначения до выделения изолированных колоний.

Далее описывают культуральные, исследуют морфологические и физиолого-биохимические признаки чистой культуры бактерий. По совокупности всех признаков определяют таксономическую принадлежность бактерии.