Лабораторная работа № мбф-1 Определение концентрации вещества и скорости изменения оптической плотности вещества с помощью колориметра

Приборы и принадлежности: фотоэлектрический колориметр, исследуемые жидкости.

Теоретическая часть

Свойство атомов и молекул поглощать свет определенных длин волн, характерных для данного вещества, широко используется в медицине и фармации для качественных и количественных исследований.

Прохождение света в любом веществе сопровождается уменьшением интенсивности светового потока. Причиной этого является расходование энергии световых волн на возбуждение атомов и молекул вещества, приводящее к излучению вторичных световых волн, или на переход в другие виды внутренней энергии (например, тепловой эффект). Данный процесс называют поглощением света. Таким образом, поглощение света – это ослабление интенсивности света при прохождении его через вещество вследствие превращения световой энергии в другие виды энергии.

Рис. 1. Прохождение света через однородный объект.

Для количественной оценки явления направим на объект из однородного вещества толщиной d параллельный поток монохроматического света (рис. 1). При прохождении света через образец происходит ослабление интенсивности света от до . Выделим в объекте элементарный (тонкий) слой толщиной dx. Изменение интенсивности света dI для этого слоя зависит от интенсивности I падающего светового потока (количество квантов, падающих слева на поверхность слоя dx в единицу времени), оптических свойств k среды (количество столкновений квантов с молекулами вещества, пропорциональное числу молекул на пути светового потока), и толщины dx слоя:

. (1)

Знак «минус» показывает, что световой поток уменьшается. Уравнение (1) представляет собой линейное дифференциальное уравнение первого порядка. Решив это дифференциальное уравнение (1), определим закон поглощения света. Для этого используем метод разделения переменных, при этом интегрируем слева от I₀ до I_d , а справа от 0 до d.

В окончательном виде получим закон Бугера

(2)

Закон Бугера можно записать через показательную функцию с основанием 10:

, где k 0,43k . (3)

Однако в медицине преимущественное значение имеет измерение поглощения света не в твердых однородных образцах, а в окрашенных жидкостях. В этом случае коэффициент поглощения k зависит не только от природы растворенного вещества и длины световой волны λ, но и от концентрации C этого вещества в растворе, что определяется законом Бэра:

, (4)

где K_λ- показатель поглощения света на единицу концентрации С вещества (зависит от природы растворенного вещества и от длины волны падающего света).

Поэтому поглощение света окрашенными растворами описывает уравнение, известное как закон Ламберта - Бэра: интенсивность светового потока, проходящего через вещество, экспоненциально уменьшается в зависимости от длины оптического пути и концентрации вещества в образце. Математическая запись этого закона имеет вид:

,

где I_d – интенсивность света, прошедшего через раствор; I₀ – интенсивность света, падающего на раствор; e – основание натурального логарифма; C – концентрация раствора; d – толщина слоя раствора, или , где k_ 0,43K_ .

График изменения интенсивности света I_d в зависимости от толщины слоя среды d, через которую проходит свет, показан на рис. 2 (экспоненциальная кривая).

Рис. 2. Зависимость интенсивности светового потока I_d, прошедшего через раствор, от толщины d слоя среды.

Для характеристики поглощения света в образце применяют физические величины:

• Коэффициент пропускания τ, равный отношению интенсивности I_d потока, прошедшего через объект, к интенсивности I₀ светового потока, падающего на него:

. (5)

Значения могут меняться от 0 (весь свет поглощается) до 1 (весь свет проходит), обычно их выражают в процентах.

• Оптическая плотность (экстинкция) D, равная десятичному логарифму отношения интенсивности I₀ света, падающего на объект, к интенсивности I_d света, прошедшего через него:

. (6)

Как видно из формулы (6), когда коэффициент пропускания падает от 100% до 0% , оптическая плотность D соответственно растет от 0 до ∞.

В этом случае закон Ламберта-Бера можно сформулировать следующим образом: оптическая плотность образца прямо пропорциональна концентрации вещества в образце и длине светового пути. В уравнении (6) величина k_ называется молярным коэффициентом поглощения. Если и , то , т. е. это оптическая плотность образца толщиной в одну единицу (1 см) при концентрации вещества 1 моль/л.

Оптическая плотность показывает поглощательную способность вещества. Поглощение тем больше, чем больше отношение , т. е. чем больше оптическая плотность.

Вещество неодинаково поглощает свет различных длин волн. Кривая зависимости оптической плотности вещества от длины волны поглощаемого света называется спектром поглощения. Обычно спектры поглощения молекул имеют непрерывный характер, но обнаруживают максимумы на той длине волны света, где имеется максимальное поглощение квантов света. На рис. 3 приведены спектры поглощения некоторых биологически важных соединений, поглощающих свет в видимой и ультрафиолетовой областях солнечного спектра. Белки имеют максимум поглощения на длине волны 280 нм, нуклеиновые кислоты—в районе 260 нм, родопсин— 500 нм, хлорофилл имеет два максимума поглощения: 430 и 680 нм.

Рис. 3. Спектры поглощения некоторых биологически важных соединений (1 — белок; 2 — ДНК; 3 — родопсин; 4 — хлорофилл).

Как видно из рисунка 3, спектры поглощения имеют иногда довольно сложный вид, характерный для данного вещества и зависящий от структуры и свойств молекул данного вещества.

Изучение спектров поглощения какого-либо фотобиологического процесса позволяет выяснить, какое вещество ответственно в данном процессе за поглощение света. Это достигается в результате сравнения спектров исследуемого процесса и спектров известных веществ. Кроме этого, по положению максимумов на шкале длин волн можно определить длину волны света, преимущественно поглощаемого этим веществом.

Знание длины волны поглощаемого света позволяет определить энергию поглощаемых квантов. А по величине энергии поглощаемых квантов можно рассчитывать расположение электронных и колебательных энергетических уровней молекулы, а также переходы молекул из одного энергетического состояния в другое. Кроме всей этой информации, величина оптической плотности дает сведения о концентрации вещества в исследуемой пробе. По величине максимумов поглощения на основании уравнения (6) можно делать заключения о концентрации вещества в исследуемом объекте.

Спектры поглощения можно измерять различными приборами. В видимом диапазоне (380-760 нм) спектр поглощения определяет цвет вещества, поэтому прибор для измерения спектров называется колориметром (от лат. color - цвет). Современные колориметры позволяют производить измерения в более широком спектральном диапазоне – от ультрафиолета до ближнего инфракрасного (315-980 нм).

Фотоколориметрический анализ широко используется в медико-биологических исследованиях. С его помощью определяют концентрации в крови:

• эритроцитов (клеток, обеспечивающих транспорт в организме кислорода и углекислого газа),

• гемоглобина (белка, заполняющего эритроциты и играющего основную роль в транспорте газов),

• оксигемоглобина (характеризующего уровень насыщения крови кислородом).

Кроме того, с помощью биохимических реакций, вызывающих избирательное окрашивание веществ, определяют в биологических материалах концентрацию белков, липидов, углеводов, гормонов и других веществ. А также определяют водородный показатель (рН) среды по цвету добавленных в раствор рН-индикаторов, активность ферментов по интенсивности окрашивания раствора после добавления соответствующих химических реагентов, дающих окрашенные реакции с продуктами ферментативной реакции (например, оценивают активность АТФ по скорости образования неорганического фосфата), скорость роста микроорганизмов по увеличению оптической плотности культуральной жидкости вследствие рассеяния света на микроорганизмах.