6.Геномная дактилоскопия и ее использование в популяционные исследования.

Генети́ческая дактилоскопи́я или ДНК-дактилоскопия— система научных методов биологической идентификации индивидуумов (организмов) на основе уникальности последовательности чередования нуклеотидовв цепочке ДНК каждого живого существа (за исключениемоднояйцевых близнецов), своеобразного «генетического отпечатка», остающегося индивидуальным и неизменным на протяжении всей жизни индивидуума (организма).

Изменчивость числа повторяющихся последовательностей ДНК человека служит основой для метода «отпечатков пальцев». Этот метод сегодня приме­няется в самых разных целях, от установления отцовства и нужд судебной медицины до выявления контрафактных мясных продуктов, в том числе китобойного промысла.

Применение VNTR(переменное число тандемных повторов)-анализа в криминалистике. С 1988 г. в США результаты изучения ДНК с помощью метода «отпечатков пальцев» принимаются в качестве улик в криминалистике. Метод используется также для мно­гих других целей, в том числе, для идентификации личности при иммиграции, под­тверждения чистопородности собак, установления отцовства и исследований, связан­ных с охраной редких видов. Стандартное криминалистическое тестирование включает определение около десяти VNTR-локусов, которые находятся в разных хромосомах.

7. Методы и перспективы генной терапии.

Генотерапия — совокупность генноинженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций.

Концепция генотерапии, появилась сразу после открытия явления трансформации у бактерийи изучения механизмов трансформации клеток животных опухолеобразующимивирусами. Такие вирусы могут осуществлять стабильное внедрение генетического материала вгеномклетки хозяина, поэтому было предложено использовать их в качествевекторовдля доставки желаемой генетической информации в геном клеток. Предполагалось, что такие векторы могут в случае необходимости поправлять дефекты генома.

Реальностью генная коррекция соматических клеток стала после 1980-х годов, когда были разработаны методы получения изолированных генов, созданы эукариотические экспрессирующие векторы, стали обычными переносы генов у мышей и других животных.

Исторически генная терапия нацеливалась на лечение наследственных генетических заболеваний, однако поле её применения, по крайней мере теоретически, расширилось. В настоящее время генную терапию рассматривают как потенциально универсальный подход к лечению широкого спектра заболеваний, начиная от наследственных, генетических и заканчивая инфекционными.

К генно-терапевтическим подходам теперь относят также и такие подходы, когда клетки модифицируют, чтобы усилить иммунный ответорганизма на нежелательные явления, вызванные инфекцией или возникновением опухолей. Модификация также осуществляется введением новой генетической информации либо в клетки, против которых хотят увеличить иммунный ответ, либо в клетки иммунной системы, с помощью которых хотят усилить этот эффект. Хотя строго говоря эта стратегия не совсем вписывается в классическое понятие генной терапии.

Главной проблемой является преодоление барьеров для проникновения терапевтического агента в опухоль с минимальной токсичностью для здоровых клеток. Модели дают очень обещающие результаты, однако даже с лучшими животными моделями остается проблема перехода к человеку, который отличается и биохимически и физиологически от модели. 

8.Кланирование животных: теория и практика.

9.Трансгенные сельскохозяйственные животные и рыбы: теория и практика.

10.Получения гормона роста и инсулина методами генной- инженерии.

Синтез соматотропина (гормона роста)

Соматотропин секретируется передней долей гипофиза. Впервые он был выделен (и очищен) в 1963 г из гипофиза. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости (1 случай на 5000 человек). Гормон обладает видовой специфичностью. Обычно его получают из гипофиза забитых на мясокомбинате животных, но в недостаточном количестве. Гормона хватает лишь для лечения 1/3 случаев гипофизарной карликовости и лишь в развитых странах. Основные производители – Швеция, Италия, Швейцария и США. Молекула ГР человека состоит из 191 аминокислотного остатка.

Принимая во внимание это обстоятельство, в настоящее время ГР синтезируют методами гинетической инженерии в специально сконструированных клетках бактерий. Будучи синтезированным в клетках E. Coli, ГР содержит дополнительный остаток метионина на H2N-конце молекулы. Биосинтез гормона роста из 191 аминокислотного остатка был впервые осуществлён в 1979 году Д. Гедделем с сотрудниками. Сначала клонировали двунитевую кДНК; далее путём расщепления получали последовательность, кодирующую аминокислотный порядок гормона, за исключением первых 23 аминокислот и синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от первой до двадцать третьей, со стартовым ATG-кодоном в начале. Затем два фрагмента объединяли и подстраивали к паре lac-промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры, что составляет 1000 000 молекул гормона на клетку.

Полученный гормон на конце полипептидной цепи содержал дополнительный остаток метионина и обладал значительной биологической активностью. С 1984 г после многолетних клинических испытаний на токсичность компанией «Генетек» (Сан-Франциско) было начато широкомасштабное производство бактериального соматотропина.

ГР в клетках E. Coli и в культуре клеток животных был получен в 1984 году одновременно в институте Пастера (Париж) и в Институте молекулярной биологии (Москва). Оказалось, что в бактериальных клетках возможен синтез аналогов ГР, с помощью которых изучались участки молекулы, важные для стимулирования роста и процесса неоглюкогенеза на молекулярном уровне.

Получение инсулина.

Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен и поддерживающий нормальный уровень сахара в крови. Недостаток этого гормона в организме приводит к одному из тяжелейших заболеваний – сахарному диабету, который как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых заболеваний и рака. Инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Синтезируется он в виде одноцепочного предшественника – проинсулина, содержащего концевой сигнальный пептид (23 аминокислотных остатка) и 35-звенный соединительный пептид (С-пептид). При удалении сигнального пептида в клетке образуется проинсулин из 86 аминокислотных остатков, в котором А и В-цепи инсулина соединены С-пептидом, обеспечивающим им необходимую ориентацию при замыкании дисульфидных связей. После протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

Известно несколько форм сахарного диабета. Самая тяжёлая форма, для лечения которой больному необходим инсулин (инсулинзависимая форма заболевания), вызвана избирательной гибелью клеток, синтезирующих этот гормон (клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе). Форма сахарного диабета, для лечения которой инсулин не требуется, распространена чаще, с ней удаётся справляться с помощью соответствующих диет и режима.

Обычно поджелудочная железа крупного рогатого скота и свиней не используется в мясной и консервной промышленности и поставляется в вагонах-рефрижераторах на фармацевтические предприятия, где проводят экстракцию гормона. Для получения 100 г кристаллического инсулина необходимо 800-1000 г исходного сырья.

Синтез обеих цепей и соединение их дисульфидными связями для получения инсулина были проведены в 1963 и 1965 гг тремя коллективами исследователей в США, Китае и Германии. В 1980 г датская компания «Ново индастри» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путём замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина. Оба инсулина не различались по активности и длительности действия.

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 30 лет назад. В 1978 году появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках E. Coli (рис. 8.21):

1.Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3'-концу гена фермента в-галактозидазы и вводился в векторную плазмиду - pBR322 (1).

2. Клетки E. Coli, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента в-галактозидазы и А и В пептида инсулина, присоединённого к ней через остаток метионина (2).

3. После обработки химерного белка бромцианом и протеолитического отщепления С-пептида образуется инсулин.

11. Виды мутации ДНК и их причины.

Мутации – это изменения в ДНК клетки. Возникают под действием ультрафиолета, радиации (рентгеновских лучей) и т.п. Передаются по наследству, служат материалом для естественного отбора. отличия от модификаций

Генные мутации – изменение строения одного гена. Это изменение в последовательности нуклеотидов: выпадение, вставка, замена и т.п. Например, замена А на Т. Причины – нарушения при удвоении (репликации) ДНК. Примеры: серповидноклеточная анемия, фенилкетонурия.

Хромосомные мутации – изменение строения хромосом: выпадение участка, удвоение участка, поворот участка на 180 градусов, перенос участка на другую (негомологичную) хромосому и т.п. Причины – нарушения при кроссинговере. Пример: синдром кошачьего крика.

Геномные мутации – изменение количества хромосом. Причины – нарушения при расхождении хромосом.

• Полиплоидия – кратные изменения (в несколько раз, например, 12 → 24). У животных не встречается, у растений приводит к увеличению размера.

• Анеуплоидия – изменения на одну-две хромосомы. Например, одна лишняя двадцать первая хромосома приводит к синдрому Дауна (при этом общее количество хромосом – 47).

Цитоплазматические мутации – изменения в ДНК митохондрий и пластид. Передаются только по женской линии, т.к. митохондрии и пластиды из сперматозоидов в зиготу не попадают. Пример у растений – пестролистность.

Соматические – мутации в соматических клетках (клетках тела; могут быть четырех вышеназванных видов). При половом размножении по наследству не передаются. Передаются при вегетативном размножении у растений, при почковании и фрагментации у кишечнополостных (у гидры).

12.Регуляция транскрипции у эукариота.

Общие принципы:

1.если у прокариот возможен синтез полицистронных мРНК, то у эукариот своеобразным функциональным аналогом полицистронной мРНК является сплайсинг мРНК.

2.наличие дистантной регуляции активности промотора с помощью элементов удаленных от него (на 100000 п.о.), т.н. upstream elements.

В регуляторной области эукариотических генов выявляется два типа цис-регуляторных элементов: общие и специфические.

Общие регуляторные элементы:

– ТАТА-бокс: TATA G/T A A/T. АТ-богатая последовательность расположенная за 30 п.н. до старта транскрипции. Существуют промоторы, лишенные ТАТА-бокса.

– INR-консенсус: YYAN T/AYY (Y-любой пиримидин). Находится в районе старта транскрипции.

– CCAAT-элемент. Занимает положения –50 или –90.

 

Специфические регуляторные элементы.

По своему действию на активность промоторов могут быть разделены на два типа:

1.энхансеры – элементы, повышающие эффективность работы промотора;

2.сайленсеры – элементы, угнетающие работу промотора.

Специфические регуляторные элементы могут находится на значительном расстоянии от промотора и их функционирование не зависит от ориентации. В структурном отношении могут представлять собой набор повторяющихся мотивов.

В последнее время интенсивно изучается еще один тип специфических регуляторных элементов, называемых инсуляторами. Эти элементы не имеют консенсусных участков, каждый инсулятор уникален по своей последовательности. В настоящее время преобладает мнение о том, что два инсулятора структурно и функционально ограничивают группу генов, активность которых регулируется независимо от других групп генов.

 

С регуляторными элементами ДНК взаимодействуют белковые транс-факторы, которые, как и регуляторные элементы, можно подразделить на общие и специфические.

1.Общие транскрипционные факторы. Узнают общие регуляторные цис-элементы и участвуют в регуляции транскрипции большинства генов. Общие факторы образуют белковый комплекс, который обеспечивает связывание ДНК-зависимой РНК полимеразы с промотором нужного гена в нужное время, точное позиционирование активного центра фермента относительно первого транскрибируемого нуклеотида и активацию фермента. Поскольку эукариоты обладают тремя разными РНК-полимеразами, то в функционировании каждой из них участвуют отличающиеся наборы общих транскрипционных факторов, которые не могут быть заменены друг другом. Примерами общих факторов являются белковые комплексы, известные как TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и т.д.

2.Специфические транскрипционные факторы. Узнают специфические регуляторные цис-элементы и контролируют транскрипцию отдельных генов или их небольших групп. Специфические факторы связывают внешние стимулы, воспринимаемые клеткой, с ответом клетки на уровне экспрессии генов. В ряде случаев они привлекают к промоторной области гена белковые комплексы (адапторные, коактиваторные), которые подготавливают ДНК-матрицу к процессу транскрипции ослабляя гистон-ДНК контакты, и, тем самым, облегчая взаимодействие с ней общих факторов транскрипции. В других случаях специфические факторы могут взаимодействовать с общими транскрипционными факторами, тем самым, привлекая их к областям активной транскрипции.

Распространенной моделью, объясняющей дистантное действие энхансеров и инсуляторов, является модель петли.

 

 

 

Петля ДНК формируется за счет белок-белковых взаимодействий между факторами, связанными с дистантными регуляторными элементами и белковым комплексом, локализующимся в районе промотора.

Обнаружены также белки, связывающиеся с последовательностями инсуляторов, у части из них известна структура, но о механизмах их действия в настоящее время известно мало. Известны инсуляторы, находящиеся внутри транспозонов (например, gypsy), однако об инсуляторах у вирусов пока ничего не известно.

Аттенуация транскрипции в эукариотических клетках. Она происходит на ранней стадии репродукции вируса. В мРНК, образующейся при транскрипции поздних генов, имеется элемент, вызывающий преждевременную терминацию транскрипции. Благодаря этому элементу невозможна транскрипция поздних генов на ранних стадиях. На поздних стадиях действуют какие-то белки, предотвращающие аттенуацию.

 Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов.

Имеется в виду пять процессов.

1.Кэпировние.

2.Полиадениилирование.

3.Сплайсинг.

4.Транспорт из ядра.

5.Стабльность РНК в цитоплазме. 

Полиаденилирование.

Сигнал в 3’-области мРНК: AAUAAA. Полиаденилирование происходит на расстоянии нескольких десятков нуклеотидов от сигнала. Дополнительные сигналы GU или U богатые элементы, которые могут находиться и до и после основного сигнала.

Предполагается, что основной сигнал находится в петле, на которой происходит образование нуклеопротеидного комплекса.

Транс-факторы: CPSF – Cleaveage and Polyadenilation specificity factor. Он вносит разрыв в мРНК после основного сигнала полиаденилирования, другой фактор CStF– Cleaveage stimulation specificity factor. Есть еще поли-А-полимераза и поли-А-связывающий белок. Факторы полиаденлирования взаимодействуют с РНК-полимеразой и системой сплайсинга.

Сплайсинг.

Существует несколько видов сплайсинга: обычный сплайсинг, самосплайсинг, транссплайсинг. Описаны случаи транссплайсинга между аденовирусной и клеточной мРНК.

Альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белков с малого количества генов. В зависимости от длины тела мРНК может по-разному происходить альтернативный сплайсинг.

SV40 и аденовирусы – почти все, у герпес-вируса только часть мРНК сплайсированы.

У SV40 альтернативный сплайсинг определяет выбор точки инициации трансляции. У аденовирусов альтернативный сплайсинг определяет выбор точки терминации трансляции.

В общем виде речь идет о взаимодействии вирусных белков с клеточной системой сплайсинга, позволяющей регулировать его во времени.

Экспорт мРНК из ядра.

В клетке используется система экспортинов. Проблема в транспорте несплайсированных форм мРНК. Сплайсированные формы экспортируются с участием белков сплайсинга. Экспорт регулируется во времени.