Стандартизация препаратов биогенных стимуляторов

Химическая природа биогенных стимуляторов как раститель­ного, так и животного происхождения окончательно не изучена, поэтому при оценке качества этих препаратов химическими методами возникают некоторые трудности. В настоящее время для стандартизации пользуются биологическими тестами. В основе методов определения биологической активности тканевых препаратов лежит способность биогенных стимуляторов активизировать обменные процессы в организме, повышать его жизнедеятельность. Этот принцип нашел свое выражение в таких тестах, как ускорение бродильной активности дрожжей, интенсивность размножения их на твердой или жидкой среде, ускорение прорастания семян растений, изменение катализной активности крови, фермента уреазы. Определяют также окисля­емость препаратов и pH растворов.

Определение бродильной энергии заключается в учете количества углекислого газа, выделяющегося при брожении. Учет производится весовым способом. Для этого используют 4 конических колбы емкостью 150—200 мл, снабженные вентилями Мейселя и затворами Бунзена. Вентиль устроен так, что выделяющийся газ при брожении должен пройти через слой кислоты серной, оставить там водяные пары и выйти наружу через затвор Бунзена. В бродильные колбы заливают по 30 мл 17% раствора сахара и 10 мл дрожжевой взвеси (10,0 г прессованных дрожжей в 100 мл дистиллированной воды). В две колбы приливают 10 мл препарата, в две — воду, закрывают пробками с затворами и взвешивают с точностью до 0,01 г. Колбы выдер­живают при температуре 22—27 °С 12 ч, после чего снова взвеши­вают, и по убыли в массе колб рассчитывают степень активации, выраженную в процентах по отношению к контролю.

Определение биологической активности препарата по усилению регенерации эпителия роговицы изолированного глаза лягушки.

В центре роговицы двух парных изолированных глаз лягушки при помощи круглого трепана с диаметром режущей коронки 1,5 — 2,0 мм счерчивают участок эпителия, затем острым скальпелем под контролем бинокулярной лупы в области этого участка удаляют эпителий роговицы до болдиновской капсулы. Получают дефекты круглой формы одинаковой величины. Один глаз помещают в испытуемый препарат, другой — в физиологи­ческий раствор при комнатной температуре на 8—16 ч. В течение этого времени происходит частичное закрытие дефекта наползающим эпителием. Затем глаза переносят в 0,005% раствор нейтрального красного на 45—60 мин (раствор красителя готовят на жидкости Рингера без добавления соды). Роговицы окрашенных глаз при помощи остроконечных ножниц вырезают по периметру (лимбу) и переносят на предметное стекло. Контуры дефектов с помощью рисовального аппарата переносят на бумагу и измеряют их площадь планометром. Сравнивают дефекты опытного и контрольного глаза; отношение площади дефекта опытного глаза к контрольному выражает степень ускорения или замедления процессов эпителизации под влиянием испытуемого препарата.

Тест на фагоцитарную активность. Для выполнения этого теста необходимо иметь цитратную кровь исследуемого животного и смыв 2-3-дневной культуры кишечной палочки с содержанием по оптическому стандарту 500 ООО. микробных тел в 1 мл. Для определения фагоцитарного числа в пробирку наливают 0,2—0,5 мл цитратной крови, добавляют 0,2—0,5 мл свежего смыва кишечной палочки, пробирки встряхивают и помещают в термостат или водяную баню при температуре 38°С на 30 мин, после чего из смеси готовят мазки, которые окрашивают по Романовскому. В мазке просматривают под микроскопом 100 сегментированных нейтрофилов и подсчитывают количество фагоцитированных ими микробов, которые составляют фаго­цитарное число. Тканевой препарат считается активным, если на 5—6-й день после введения отмечается увеличение количества эритроцитов на 15—25%, гемоглобина на 12—13%, повышение фагоцитарного числа в 1,5—1 раза.

Определение окисляемости. Методику определения окисляемости можно рассмотреть на экстракте алоэ жидком. 2 мл вытяжки разбавляют дистиллированной водой до 100 мл. 20 мл этого раствора переносят в колбу на 200 мл, содержащую 100 мл свежепрокипяченной дистиллированной воды, прибавляют 5 мл 25% раствора серной кислоты и 20 мл 0,1 н раствора калия перманганата и кипятят на сетке 10 мин, считая с момента закипания жидкости. К горячему раствору прибавляют 20 мл 0,01 н раствора щавелевой кислоты и жидкость титруют до изменения окраски 0,01 н раствора калия перманганата, после чего определяют окисляемость — количество миллиграммов кислорода в 1 л препарата. 1 мл 0,01 н раствора калия перманганата соответствует 0,008 мл кислорода. Окисляемость должна быть 300 мл кислорода.

43. Максимально очищенные (новогаленовые) фитопрепараты. Определение. Характеристика. Роль российских ученых в создании и организации производства. Общая технологическая и аппаратурная схемы получения. Способы экстрагирования лекарственного растительного сырья в технологии новогаленовых препаратов и их очистка.

Новогаленовые (максимально очищенные экстракционные) препараты — это фитопрепараты, содержащие в своем составе действующие вещества исходного лекарственного сырья в их нативном (природном) состоянии, максимально освобожденные от сопутствующих веществ. Глубокая очистка повышает их стабильность, устраняет побочное действие ряда сопутствующих веществ (смолы, стерины, протеины и др.), позволяет использовать для инъекционного применения. Кроме того, в отличие от галеновых препаратов, которые в ряде случаев стандартизуют по сухому остатку, новогаленовые препараты выпускают стандартизованными биологическими или химическими методами по действующим веществам.

В конце XIX в. в Германии предложен первый новогаленовый препарат «Дигипурат». В 1923 г. в ВНИХФИ под руководством профессора О. А. Степуна была разработана и внедрена в практику технология получения препарата «Адонилен», предложены методы приготовления таких препаратов, как «Гиптален», «Дигинорм», «Франгулем», «Секален» и т. д.

Изучением природных соединений и разработкой технологий по созданию новых препаратов из лекарственного сырья занимались в ГНЦЛС, Украина (И. М. Макаревич), В. И. Литвиненко, Н. Ф. Комисаренко, П. П. Прокопенко, В. Т. Чернобай и др.), в Институте химии растительных веществ, Академии наук Узбекистана, ВНИХФИ (Москва), Институте фармакохимии им. К. Г. Кутателадзе (Грузия), на кафедрах фармацевтических академий, университетов и факультетов медицинских вузов.

Особенности производства

Общий принцип приготовления суммарных препаратов и препаратов индивидуальных веществ заключается в том, что в зависимости от свойств растительного материала и содержащихся в нем биологически активных веществ подбирают такой извлекатель и такой метод извлечения, при использовании которых извлекается максимальное количество действующих веществ и минимальное количество сопутствующих.

Производство максимально очищенных препаратов и препаратов индивидуальных веществ осуществляют по единой технологической схеме:

1. Подготовка растительного материала.

2. Подготовка экстрагента или смеси экстрагентов.

3. Получение вытяжки.

4. Концентрирование.

5. Очистка вытяжки.

6. Получение технического продукта.

7. Очистка технического продукта.

8. Стандартизация.

9. Упаковка, маркировка и фасовка готового продукта.

Стадию 7 обычно применяют в технологии более глубокой очистки БАВ — в производстве индивидуальных веществ, где используют кристаллизацию из органических растворителей или комбинированные методы (сорбцию, десорбцию, концентрирова¬ние, кристаллизацию).

При выборе метода экстракции стремятся с наименьшей затратой времени и экстрагента получить концентрированное, т. е. обогащенное действующими веществами извлечение. Наиболее широко при получении новогаленовых препаратов используют противоточную экстракцию, иногда мацерацию с циркуляцией экстрагента или с механическим перемешиванием, а также циркуляционную экстракцию.

Экстрагирование индивидуальных веществ проводят дробной мацерацией по принципу противотока, мацерацией с циркуляцией экстрагента, вихревой экстракцией, иногда сырье перед экстрагированием специально обрабатывают (ферментация, при производстве дигитоксина). Из полученного извлечения экстрагент удаляют упариванием в роторных испарителях, в которых вытяжка подвергается кратковременному контакту с поверхностью теплоносителя при глубоком вакууме (остаточное давление 1333,22—1999,83 Н/м2). Для уменьшения потерь органического растворителя на всех стадиях упаривания охлаждение паров осуществляют рассолом.

При получении максимально очищенных препаратов в основном применяют следующие методы: осаждение действующих или сопутствующих веществ с применением органических растворителей; очистка в системах жидкость—жидкость; абсорбционную хроматографию (для очистки и разделения сердечных гликозидов, флавоноидов, кумаринов и др.); ионообменную хроматографию для очистки вытяжек, содержащих алкалоиды (фенольные соединения, ферменты, антибиотики, витамины), кристаллизацию. Применяют следующие методы кристаллизации: выпаривание растворителя (изотермический), охлаждение горячих растворов (изогидрический), одновременное охлаждение и выпаривание (комбинированный), использование других веществ, снижающих растворимость (высаливание).

Процесс получения индивидуальных веществ сложный и многоступенчатый, главным образом на стадиях их выделения и очистки.

Первоначально индивидуальные вещества получают применяя экстракционную технологию, основанную на различных коэффициентах распределения веществ в несмешивающихся между собой экстрагентах. Этот процесс оптимальный для выделения веществ из растворов, содержащих ограниченное количество биологически активных веществ, которые отличаются по своим физико-химическим свойствам от сопутствующих веществ. Метод относительно прост для производства препаратов в малых масштабах. При переходе к крупнопромышленному производству возникает целый ряд технологических, экономических и экологических проблем.

Природное сырье как источник лекарственных веществ обладает по сравнению с синтетическими веществами рядом особенностей, определяющих процесс выделения индивидуальных соединений высокой степени чистоты как весьма сложный. Растительное сырье имеет свои отличительные признаки, которые характеризуются: непостоянством количественного, а часто и качественного состава веществ, зависящего от места произрастания, климатических условий, способа уборки растительного сырья, условий его сушки, степени загрязненности микрофлорой; наличием химических соединений, родственных основному выделяемому веществу по химическим свойствам и структуре, но резко отличающихся по биологическому действию; ограниченной химической стабильностью многих природных соединений; способностью легко подвергаться воздействию ферментов и микроорганизмов.

На стадии очистки извлечения культуральные жидкости подвергают последовательной обработке, целью которой является выделение комплекса действующих веществ в нативном состоянии или индивидуальных БАВ, свободных от сопутствующих веществ. Приемы и способы очистки БАВ весьма разнообразны и индивидуальны. Необходимость применения конкретного метода зависит от начальных свойств извлечения или культуральной жидкости (вязкости, концентрации продукта, наличия примесей и нежелательных нерастворимых веществ), а также от требуемой степени чистоты и конечной формы продукта (кристаллическое вещество, его концентрированный раствор, высушенный порошок и т. д.). Неочищенный продукт можно выделить, например, путем упаривания извлечения или культуральной жидкости после экстрагирования.

Последовательность стадий очистки при получении высокоочищенных БАВ выглядит следующим образом:

1. Отделение нерастворимых веществ. Для этой цели обычно используют фильтрование, центрифугирование, отстаивание, седиментацию и декантацию.

2. Очистка БАВ. На стадии очистки БАВ обычно происходит отделение примесей, а также дальнейшее концентрирование продукта. В этом случае чаще всего используют фракционное осаждение, экстракцию в системах жидкость — жидкость, разделение с помощью мембран, различные сорбционно-хроматографические методы.

3. Окончательная очистка БАВ. В рамках такой технологии обычно применяют центрифугирование, кристаллизацию, сушку распылением, лиофилизацией (вымораживанием) или отгонку органического растворителя.

Методы осаждения БАВ из растворов

Осаждение белков, камедей, слизей, пектинов из водных растворов основано на изменении их растворимости при добавлении значительных количеств определенных веществ. Так, при добавлении в вытяжку раствора электролита, образующиеся ионы электролита гидратируются, обезвоживая молекулы биополимера. При этом исчезает защитный гидратный слой молекул, наблюдается слипание частиц и осаждение биополимера. Высаливание очень широко применяется для очистки белковых гормонов (гипофиза, поджелудочной, щитовидной и паращитовидных желез), стероидных гормонов, ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы, продуктов биосинтеза, простагландинов из плазмы крови человека.

Осаждение биополимеров осуществляют и органическими растворителями (спирт, ацетон), проводимое при охлаждении — один из распространенных способов концентрирования растворов, содержащих белки, слизи, пектины.

Он имеет ряд преимуществ перед высаливанием, в частности возможность регенерации, что положительно сказывается на экономических показателях технологического процесса. Однако органические растворители не обладают способностью осаждения белков и других биополимеров.

При выборе конкретного метода осаждения необходимо учитывать не только степень обогащения и затраты на осаждение, но и требуемую степень чистоты биополимера.

Разделение БАВ с помощью мембран

В настоящее время в химико-фармацевтической и микробиоло­гической промышленности все более широко получают сложные термически и химически лабильные органические соединения. Требуются «мягкие» условия производства, которым в значительной степени отвечают мембранные процессы. Внедрение мембранных процессов позволяет интенсифицировать технологию концентрирования биологически активных веществ, сокращая при этом потери их активности. Мембранные методы разделения смесей, содержащих биополимеры, значительно повышают качество продукции.

Основой разработки современных экономических мембранных процессов явилось получение и последующее усовершенствование высокоселективных ацетатцеллюлозных и синтетических мембран.

В странах СНГ получили распространение ацетатцеллюлозные мембраны «Владипор», «Мифил» и синтетические полу­проницаемые мембраны — из сополимера винилпирролидона с метилметакрилатом. За рубежом широко применяет мембраны фирм «Абкор», «Миллипор» (США), «Шляйхер Шуель», «Сарториус» (Германия), «Амикон» (Голландия), «Нуклеопор» (Великобритания), комплексные системы ДДС-РО (Дания) для ультрафильтрации и концентрирования (обратный осмос), изготовленные на основе нейлона, поливинилхлорида, тефлона, ацетата нитроцеллюлозы.

Среди жидкофазных мембранных процессов различают диализ, электродиализ, ультрафильтрацию, обратный осмос.

Диализ и электродиализ

Диализ основан на свойствах молекул биополимеров, имеющих большие размеры, не проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как вещества с меньшими размерами молекул проходят через них довольно свободно. Для диализа используют пленки желатина, целлофана, коллодия, нитроцеллюлозы. Процесс диализа протекает обычно довольно медленно, он ускоряется при повышении температуры, увеличении площади диализа и приложении электрического тока. В последнем случае наблюдается явление электродиализа, которому подвержены в основном вещества, распадающиеся на ионы.

Ультрафильтрация

Метод ультрафильтрации заключается в разделении высокомо­лекулярных и низкомолекулярных соединений на селективных мембранах, способных пропускать низкомолекулярные соединения под действием давления 1—5 кг/см².

Обратный осмос

Обратный осмос (гиперфильтрация) — переход растворителя (воды) из раствора через полупроницаемую мембрану под действием внешнего давления.

Сорбция

Методы очистки БАВ сорбцией в настоящее время нашли широкое применение в химико-фармацевтической и микробиоло­гической промышленности.

Сорбцией называют процесс поглощения газов, паров, растворенных веществ твердыми и жидкими сорбентами. Различают несколько видов сорбции.

Адсорбция — поглощение вещества на поверхности сорбента. Процесс адсорбции имеет селективность и позволяет адсорбировать определенные БАВ из раствора.

Абсорбция — поглощение вещества всем объемом твердой или жидкой фазы. Абсорбцию используют, например, при получении эфирных масел.

Хемосорбция — поглощение веществ с образованием химических соединений. К хемосорбции относятся ионный обмен, аффинная и гидрофобная хроматография. В производстве БАВ растительного и животного происхождения и на основе биосинтеза в основном используют адсорбцию.

Сорбционный процесс выделения веществ из раствора смеси веществ представляет собой единство процессов сорбции и десорбции. Процесс десорбции разделен на два этапа: собственно десорбцию, т. е. получение элюата, содержащего целевой продукт, и регенерацию, т. е. удаление из сорбента всех сорбировавшихся веществ, позволяющих вернуть сорбент вновь на стадию адсорбции.

Ионообменная хроматография

Хроматография БАВ с помощью ионообменных сорбентов, называемая ионообменной, является одним из методов разделения, имеющих наибольшую продолжительную историю развития. В основе ионообменной хроматографии лежит реакция обмена между неподвижным твердым ионообменным сорбентом и растворенным в растворителе веществом.

Гель-фильтрация

Гель-фильтрация, или хроматография на молекулярных ситах, позволяет разделять вещества с различными молекулярными массами. В этом случае насадка колонки состоит из частиц геля с определенным диаметром пор. Если размер молекул больше диаметра пор, то они не могут диффундировать в гель и быстро проходят через колонку, тогда как молекулы меньшего размера проникают в гель и поэтому движутся более медленно.

Гидрофобная хроматография

Метод гидрофобной хроматографии используют для разделения БАВ на основе гидрофобных свойств, характерных для биологических объектов.

В основе механизма селективности при гидрофобной хроматографии лежит проявление так называемого гидрофобного эффекта, а также модуляция электровалентных взаимодействий, вследствие понижения локальной диэлектрической постоянной среды при введении неполярных радикалов или понижении активности растворителя.

Электрофорез

Электрофорезом называют разделение БАВ благодаря различной скорости их перемещения в электрическом поле.

В методе электрофореза в потоке жидкая, фаза двигается перпендикулярно направлению электрического поля, что позволяет осуществлять непрерывное разделение.

Кристаллизация

Процесс образования и роста кристаллов из растворов и газовой фазы называют кристаллизацией.

Методы кристаллизации: выпаривание растворителя (изотермический), охлаждение горячих растворов (изогидрический), одновременное охлаждение и выпаривание (комбинированный), добавление в раствор других веществ, снимающих растворимость (высаливание), вымораживание.

В фармацевтической промышленности кристаллизацией выделяют твердые вещества из их растворов, разделяют смеси веществ на фракции и очищают их от примесей.

Экстракция в системах жидкость—жидкость

В основе жидкостной экстракции лежит переход вещества из одной жидкости (раствора) в другую, не смешивающуюся с первой.

В результате взаимодействия экстрагента с исходной жид­костью получают экстракт-раствор извлеченных веществ и рафинат — остаточный исходный раствор, обедненный извлекаемыми веществами и содержащий некоторое количество экстрагента.

44. Органопрепараты. Определение. Характеристика. Классификация. Особенности животного сырья. Общая технологическая и аппаратурная схемы производства. Получение препаратов из животного сырья для внутреннего применения.

Препараты, получаемые из животного сырья (орга­нов, тканей, крови, мочи и т.д.), известны под назва­нием органотерапевтические или органопрепараты.

В зависимости от природы фармакологически активных веществ их можно подразделить на препара­ты: гормонов, ферментов и препараты неспецифиче­ского действия. В зависимости от органа, из которого они получены, различают препараты из гипофиза, поджелудочной и щитовидной желез, печени и т. д. По способу получения и степени очистки их разделяют на высушенные, обезжиренные и измельченные железы и ткани; экстракционные — для внутреннего употреб­ления; инъекционные, которые подразделяют на макси­мально очищенные экстракты и препараты индивиду­альных веществ.