Вопросы по Биохимии для лечебного факультета на 2014/2015 учебный год
Аминокислоты, классификация и строение протеиногенных кислот. Зависимость заряда аминокислот от рН среды. Изоэлектрическая точка. Характеристика пептидной связи. Первичная структура белков, методы определения. Зависимость биологических свойств белков от первичной структуры. Видовая специфичность первичной структуры белков.
Белки - полимерные молекулы, в которых мономерами служат аминокислоты. В составе белков в организме человека встречают только 20 ?-аминокислот. Одни и те же аминокислоты присутствуют в различных по структуре и функциям белках. Общая структурная особенность аминокислот - наличие амино- и карбоксильной групп, соединённых с одним и тем же ?-углеродным атомом. 19 из 20 аминокислот содержат в ?-положении асимметричный атом углерода, с которым связаны 4 разные замещающие группы. В результате эти аминокислоты в природе могут находиться в двух разных изомерных формах - L и D. В составе белков присутствуют только L-изомеры аминокислот.
2. Классификация аминокислот
По химическому строению аминокислоты можно разделить на алифатические, ароматические и гетероциклические.
3. Классификация аминокислот по растворимости их радикалов в воде
Все 20 аминокислот в белках организма человека можно сгруппировать по способности их радикалов растворяться в воде. Радикалы можно выстроить в непрерывный ряд, начинающийся полностью гидрофобными и заканчивающийся сильно гидрофильными. Растворимость радикалов аминокислот определяется полярностью функциональных групп, входящих в состав молекулы.
Аминокислоты с неполярными радикалами
К неполярным (гидрофобным) относят радикалы, имеющие алифатические углеводородные цепи (радикалы аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина и метионина) и ароматические кольца (радикалы фенилаланина и триптофана). Радикалы таких аминокислот в воде стремятся друг к другу или к другим гидрофобным молекулам, в результате чего поверхность соприкосновения их с водой уменьшается.
Аминокислоты с полярными незаряженными радикалами
Радикалы этих аминокислот лучше, чем гидрофобные радикалы, растворяются в воде, так как в их состав входят полярные функциональные группы, образующие водородные связи с водой. К ним относят серии, треонин и тирозин, имеющие гидроксильные группы, аспарагин и глутамин, содержащие амидные группы, и цистеин с его тиольной группой.
Аминокислоты с полярными отрицательно заряженными радикалами
К этой группе относят аспарагиновую и глутаминовую аминокислоты, имеющие в радикале дополнительную карбоксильную группу. Следовательно, радикалы данных аминокислот - анионы.
Аминокислоты с полярными положительно заряженными радикалами
Дополнительную положительно заряженную группу в радикале имеют лизин и аргинин.
Наибольшей растворимостью в воде обладают полярные заряженные радикалы аминокислот.
4. Изменение суммарного заряда аминокислот в зависимости от рН среды
При нейтральных значениях рН все кислотные (способные отдавать Н+) и все основные (способные присоединять Н+) функциональные группы находятся в диссоциированном состоянии. Поэтому в нейтральной среде аминокислоты, содержащие недиссоциирующий радикал, имеют суммарный нулевой заряд. Аминокислоты, содержащие кислотные функциональные группы, имеют суммарный отрицательный заряд, а аминокислоты, содержащие основные функциональные группы, - положительный заряд. Изменение рН в кислую сторону (т.е. повышение в среде концентрации Н+) приводит к подавлению диссоциации кислотных групп. В сильно кислой среде все аминокислоты приобретают положительный заряд. Напротив, увеличение концентрации ОН- групп вызывает отщепление Н+ от основных функциональных групп, что приводит к уменьшению положительного заряда. В сильно щелочной среде все аминокислоты имеют суммарный отрицательный заряд.
?-Аминокислоты могут ковалентно связываться друг с другом с помощью пептидных связей. Пептидная связь образуется между а-карбоксильной группой одной аминокислоты и ?-аминогруппой другой, т.е. является амидной связью. При этом происходит отщепление молекулы воды.
Пептидная связь имеет характеристику частично двойной связи, поэтому она короче, чем остальные связи пептидного остова, и вследствие этого мало подвижна. Электронное строение пептидной связи определяет плоскую жёсткую структуру пептидной группы. Плоскости пептидных групп расположены под углом друг к другу. Связь между ?-углеродным атомом и ?-аминогруппой или ?-карбоксильной группой способна к свободным вращениям (хотя ограничена размером и характером радикалов), что позволяет полипептидной цепи принимать различные конфигурации. Пептидные связи обычно расположены в транс-конфигурации, т.е. ?-углеродные атомы располагаются по разные стороны от пептидной связи. В результате боковые радикалы аминокислот находятся на наиболее удалённом расстоянии друг от друга в пространстве. Пептидные связи очень прочны и самопроизвольно не разрываются при нормальных условиях, существующих в клетках. В некоторых белках имеются нестандартные модифицированные аминокислоты - производные одной из этих 20 аминокислот. Например, в молекуле коллагена присутствуют гидроксипроизводные лизина и пролина - 5-гидроксилизин и 4-гидроксипролин.
Установление первичной структуры белков включает 2 основных этапа:
определение аминокислотного состава изучаемого белка(Кислотный гидролиз белка, Разделение аминокислот с помощью ионообменной хроматографии, Количественный анализ полученных фракций)
определение аминокислотной последовательности в белке(Определение N-концевой аминокислоты в белке и последовательности аминокислот в олигопептидах, Ферментативное расщепление полипептида по специфическим участкам, Химическое расщепление полипептида по специфическим участкам, Получение аминокислотной последовательности полипептида с помощью перекрывающихся фрагментов)
Конформация пептидных цепей (вторичная и третичная структуры). Дисульфидные, водородные, гидрофобные и ионные связи в стабилизации конформации белковой молекулы. Супервторичная структура белков. Четвертичная структура белков. Кооперативные изменения конформации протомеров при функционировании белков. Возможность адаптивной регуляции биологической функции олигомерных белков с помощью аллостерических лигандов. Доменная структура белков. Функционирование белков. Комплементарность центра связывания белков структуре лиганда.
Линейные полипептидные цепи индивидуальных белков за счёт взаимодействия функциональных групп аминокислот приобретают определённую пространственную трёхмерную структуру, называемую "конформация". В белках различают 2 основных типа конформации полипептидных цепей: вторичную и третичную структуры.
Вторичная структура белков - пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами, входящими в состав пептидного остова. При этом пептидные цепи могут приобретать регулярные структуры двух типов: ?-спираль и ?-структура.
?-Спираль. В данном типе структуры пептидный остов закручивается в виде спирали за счёт образования водородных связей между атомами кислорода карбонильных групп и атомами азота аминогрупп, входящих в состав пептидных групп через 4 аминокислотных остатка. На один виток ?-спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. В образовании водородных связей участвуют практически все атомы кислорода и водорода пептидных групп. Радикалы аминокислот находятся на наружной стороне ?-спирали и направлены от пептидного остова в стороны.
?-Структура формируется за счёт образования множества водородных связей между атомами пептидных групп линейных областей одной полипептидной цепи, делающей изгибы, или между разными полипептидными цепями, ?-Структура образует фигуру, подобную листу, сложенному "гармошкой", - ?-складчатый слой. В ?-структурах водородные связи расположены перпендикулярно полипептидной цепи.
Как ?-спираль, так и ?-структуры обнаружены в глобулярных и фибриллярных белках.
Третичная структура белков - трёхмерная пространственная структура, образующаяся за счёт взаимодействий между радикалами аминокислот, которые могут располагаться на значительном расстоянии друг от друга в полипептидной цепи.
Гидрофобные взаимодействия. При укладке полипептидная цепь белка стремится принять энергетически выгодную форму, характеризующуюся минимумом свободной энергии. Поэтому гидрофобные радикалы аминокислот стремятся к объединению внутри глобулярной структуры растворимых в воде белков. Между ними возникают так называемые гидрофобные взаимодействия, а также силы ван дер Ваальса между близко прилегающими друг к другу атомами. В результате внутри белковой глобулы формируется гидрофобное ядро. Гидрофильные группы пептидного остова при формировании вторичной структуры образуют множество водородных связей, благодаря чему исключается связывание с ними воды и разрушение внутренней, плотной структуры белка.
Ионные и водородные связи
Ионные связи могут возникать между отрицательно заряженными (анионными) карбоксильными группами радикалов аспарагиновой и глутаминовой кислот и положительно заряженными (катионными)
группами радикалов лизина, аргинина или гистидина.
Водородные связи возникают между гидрофильными незаряженными группами (такими как -ОН, -CONH2, SH-группы) и любыми другими гидрофильными группами.
Ковалентные связи.Третичную структуру некоторых белков стабилизируют дисульфидные связи, образующиеся за счёт взаимодействия SH-групп двух остатков цистеина. Эти два остатка цистеина могут находиться далеко друг от друга в линейной первичной структуре белка, но при формировании третичной структуры они сближаются и образуют прочное ковалентное связывание радикалов.
Пространственная структура каждого белка индивидуальна и определяется его первичной структурой. Однако сравнение конформаций разных по структуре и функциям белков выявило наличие у них похожих сочетаний элементов вторичной структуры. Такой специфический порядок формирования вторичных структур называют супервторичной структурой белков. Супервторичная структура формируется за счёт межрадикальных взаимодействий.
Определённые характерные сочетания ?-спиралей и ?-структур часто обозначают как "структурные мотивы". Они имеют специфические названия: "?-спираль-поворот- ?-спираль", "структура ?-бочонка", "лейциновая застёжка-молния", "цинковый палец" и др. Специфическое пространственное расположение ?-спиралей и ?-структур формируется за счёт межрадикальных взаимодействий.
Многие белки содержат в своём составе только одну полипептидную цепь. Такие белки называют мономерами. К мономерным относят и белки, состоящие из нескольких цепей, но соединённых ковалентно, например дисульфидными связями. В то же время существуют белки, состоящие из двух и более полипептидных цепей.гидрофобных, ионных, водородных. Количество и взаиморасположение полипептидных цепей в пространстве называют "четвертичная структура белков". Отдельные полипептидные цепи в таком белке носят название протомеров, или субъединиц. Белок, содержащий в своём составе несколько протомеров, называют олигомерным.
О2 связывается с протомерами гемоглобина через Fe2+ , который соединён с четырьмя атомами азота пиррольных колец тема и атомом азота. Связывание О2 с оставшейся свободной координационной связью Fe2+ происходит по другую сторону от плоскости гема в области Гис Е7 (аналогично тому, как это происходит у миоглобина). Гис Е7 не взаимодействует с О2, но обеспечивает оптимальные условия для его связывания. В дезоксигемоглобине благодаря ковалентной связи с белковой частью атом Fe2+ выступает из плоскости гема в направлении Гис F8. Присоединение О2 к атому Fe2+ одного протомера вызывает его перемещение в плоскость гема, за ним перемещаются остаток Гис F8 и полипептидная цепь, в состав которой он входит. Так как протомер связан с остальными протомерами, а белки обладают конформационной лабильностью, происходит изменение конформации всего белка. Конформационные изменения, произошедшие в других протомерах, облегчают присоединение следующей молекулы О2, что вызывает новые конформационные изменения в белке и ускорение связывания следующей молекулы О2. Четвёртая молекула О2 присоединяется к гемоглобину в 300 раз легче, чем первая молекула Изменение конформации (а следовательно и функциональных свойств) всех протомеров олигомерного белка при присоединении лиганда только к одному из них носит название кооперативных изменений конформации протомеров.
Связывание одного протомера с лигандом изменяет конформацию этого протомера, а также всего олигомера и, кроме того, сродство к другим лигандам. Таким образом, функциональная активность олигомерных белков может регулироваться аллостерическими лигандами.
Если полипептидная цепь белка содержит более 200 аминокислот, как правило, её пространственная структура сформирована в виде двух или более доменов. Домен - участок полипептидной цепи, который в процессе формирования пространственной структуры приобрёл независимо от других участков той же цепи кон-формацию глобулярного белка. Так, лёгкая цепь иммуноглобулина G состоит из двух доменов. В некоторых случаях доменами называют отдельные структурные участки полипептидной цепи. Каждый индивидуальный белок, имеющий уникальную первичную структуру и конформацию, обладает и уникальной функцией, отличающей его от bqcx остальных белков. Набор индивидуальных белков выполняет в клетке множество разнообразных и сложных функций.
Необходимое условие для функционирования белков - присоединение к нему другого вещества, которое называют "лиганд". Лигандами могут быть как низкомолекулярные вещества, так и макромолекулы. Взаимодействие белка с лигандом высокоспецифично, что определяется строением участка белка, называемого центром связывания белка с лигандом или активным центром. Активный центр белков - определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении ("кармане"), сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. Под комплементарностью понимают пространственное и химическое соответствие взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и пространственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и "подгоняется" под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными.
Лабильность пространственной структуры белков и их денатурация. Факторы, вызывающие денатурацию. Механизм денатурации. Применение денатурирующих агентов в биологических исследованиях и медицине. Роль шаперонов в предотвращении денатурации белков. Ренативация белков.
Гидрофобные взаимодействия, а также ионные и водородные связи относят к числу слабых. Однако белки состоят из огромного числа атомов, находящихся в постоянном (броуновском) движении, что приводит к небольшим перемещениям отдельных участков полипептидной цепи, которые обычно не нарушают общую структуру белка и его функции. Следовательно, белки обладают конформационной лабильностью - склонностью к небольшим изменениям конформации за счёт разрыва одних и образования других слабых связей. Разрыв большого количества слабых связей в молекуле белка приводит к разрушению её на-тивной конформации. Так как разрыв связей под действием различных факторов носит случайный характер, то молекулы одного индивидуального белка приобретают в растворе форму случайно сформировавшихся беспорядочных клубков, отличающихся друг от друга трёхмерной структурой. Потеря нативной конформации сопровождается утратой специфической функции белков. Этот процесс носит название денатурации белков. При денатурации белков не происходит разрыва пептидных связей, т.е. первичная структура белка не нарушается.
В денатурированном белке гидрофобные радикалы, которые в нативной структуре молекулы спрятаны внутри гидрофобного ядра, оказываются на поверхности. При достаточно высокой концентрации белка и отсутствии сильного отталкивающего заряда молекулы могут объединяться друг с другом гидрофобными взаимодействиями, при этом растворимость белка снижается и происходит образование осадка.
высокая температура (более 50 °С), увеличивающая тепловое движение атомов в молекуле и приводящая к разрыву слабых связей;
интенсивное встряхивание раствора, приводящее к соприкосновению белковых молекул с воздушной средой на поверхности раздела фаз и изменению конформации этих молекул;
органические вещества (например, этиловый спирт, фенол и его производные) способны взаимодействовать с функциональными группами белков, что приводит к их конформа-ционным изменениям. Для денатурации белков в биохимических исследованиях часто используют мочевину или гуанидинхлорид, которые образуют водородные связи с амино- и карбонильными группами пептидного остова и некоторыми функциональными группами радикалов аминокислот. Происходит разрыв связей, участвующих в формировании вторичной и третичной структуры нативных белков, и образование новых связей с химическими реагентами;
кислоты и щелочи, изменяя рН среды, вызывают перераспределение связей в молекуле белка;
соли тяжёлых металлов (такие как медь, ртуть, серебро, свинец и др.) образуют прочные связи с важными функциональными группами белков (чаще всего с -SH), изменяя их конформацию и активность;
детергенты - вещества, содержащие гидрофобный углеводородный радикал и гидрофильную функциональную группу (такие вещества называют амфифильными). К наиболее известным детергентам относят различные мыла.
В биохимических исследованиях перед определением в биологическом материале низкомолекулярных соединений из раствора обычно удаляют белки. Для этой цели чаще всего используют трихлоруксусную кислоту, её можно также использовать для денатурации ферментов в целях прекращения ферментативной реакции.В медицине - для стерилизации медицинских инструментов и материала, а также в качестве антисептиков. Фенол и его производные (крезол, резорцин) относят к известным антисептикам ароматического ряда. Обладающие высокой гидрофобностью, они эффективно действуют на вегетативные формы бактерий и грибы, вызывая денатурацию их белков. Раствор крезола в калийном мыле известен как препарат лизол, применяемый в качестве дезинфицирующего средства. Берёзовый дёготь - одна из основных составных частей мази Вишневского, содержит в своем составе фенол. Препарат, используемый для лечения ран, обладает высоким антимикробным действием. Значительное количество антисептиков представлено солями тяжёлых металлов. Их антимикробное действие связано с тем, что уже в довольно низких концентрациях они взаимодействуют с белками микроорганизмов, блокируют их SH-группы и изменяют их конформа-цию.(HgCl2). Её используют для обработки рук и дезинфекции помещений. Антимикробными свойствами обладают и препараты серебра, такие как ляпис (AgNO3), колларгол (серебро коллоидальное), применяемые для обработки слизистых оболочек при инфекционных заболеваниях. Однако если путём диализа очистить рибонуклеазу от денатурирующих агентов и ?-меркаптоэтанола, ферментативная активность белка постепенно восстанавливается. Этот процесс называется ренатурацией, или ренативацией белка.
В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционно-способные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков. Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ). При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия, инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение моляр-ности среды, действие токсичных химических веществ, тяжёлых металлов и т.д.) в клетках усиливается синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и восстанавливать натив-ную конформацию белков. Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной ишемии, вызванной стенокардией или закупоркой сосудов сердца тромбом.
Физико-химические свойства белков: молекулярная масса, размеры и форма белковой молекулы, растворимость. Факторы стабилизации белковых растворов. Механизм возникновения электрического заряда белков, зависимость от рН. Изоэлектрическая точка белка.
Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному зарядумолекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.1. Различия белков по форме молекул. Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большинстве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях организма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).2. Различия белков по молекулярной массе. Белки - высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от количества аминокислотных остатков в полипептидной цепи, а для олигомерных белков - и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц). 3. Суммарный заряд белков. Белки имеют в своём составе радикалы лизина, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах полипептидных цепей имеются α-амино- и α-карбоксильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис. Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кислой среде увеличение концентрации протонов (Н+) приводит к подавлению диссоциации карбоксильных групп и уменьшению отрицательного заряда белков: -СОО- + Н+ → -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH3+с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белков.Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют"изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково, т.е. белок находится в изоэлектрическом состоянии.Так как большинство белков в клетке имеет в своём составе больше анионогенных групп (-СОО-), то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белков, в составе которых преобладают катионогенные группы, находится в щелочной среде. Наиболее яркий пример таких внутриклеточных белков, содержащих много аргинина и лизина, - гистоны, входящие в состав хроматина.4. Растворимость белков. Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Например, некоторые белки легче растворяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. С другой стороны, увеличение концентрации нейтральных солей может способствовать вьшадению определённых белков в осадок. Денатурирующие агенты, присутствующие в растворе, также снижают растворимость белков.
Большинство белков гидрофильны. Однако белковые молекулы имеют очень большие размеры, поэтому белки не могут образовывать истинных растворов, а только коллоидные. Факторы стабилизации белка в растворе.1) Гидратная Оболочка - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами. 2) Заряд Белковой Молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО- и NH3+ группы.
Методы выделения индивидуальных белков: избирательное осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография.
Многообразие белков. Глобулярные и фибриллярные белки. Простые белки: общая характеристика. Сложные белки: классификация, общая характеристика. Классификация белков по биологическим функциям. Семейства родственных белков (сериновые протеазы, иммуноглобулины).
Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность взаимодействия с антигеном. Многообразие антигенсвязывающих участков Н и L цепей. Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования.