125. Реакция непрямой гемагглютинации, механизм, методы постановки, практическое применение.

В основе реакции гемагглютинации лежит феномен склеивания эритроцитов, происходящий под влиянием различных факторов. Различают прямую и непрямую гемагглютинацию. При реакции прямой гемагглютинации происходит склеивание эритроцитов при адсорбции на них определенных антигенов, например вирусов. В серологических исследованиях применяют реакцию торможения прямой гемагглютинации, когда выделенный у больного вирус нейтрализуют специфической иммунной сывороткой, а затем соединяют с эритроцитами. Отсутствие гемагглютинации говорит о соответствии вируса и используемой иммунной сыворотки. Реакция непрямой гемагглютинации (пассивная гемагглютинация) наблюдается в тех случаях, когда к эритроцитам, заранее обработанным (сенсибилизированным) различными антигенами, прибавляют иммунную сыворотку или сыворотку больного, имеющую соответствующие антитела. Происходит специфическое Склеивание эритроцитов, их пассивная гемагглютинация. Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации по чувствительности и специфичности превосходит другие серологические методы, и ее используют при диагностике инфекций, вызванных бактериями, риккетсиями, простейшими. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации состоит из нескольких этапов.

Вначале эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия, затем при необходимости (при использовании антигенов белковой природы) их обрабатывают раствором танина 1 : 20000 и сенсибилизируют растворимыми антигенами. После отмывания буферным изотоническим раствором хлорида натрия эритроцитарный антиген готов к употреблению. Исследуемые сыворотки разводят изотоническим раствором хлорида натрия в пробирках или специальных пластмассовых пластинках с луночками, затем к каждому разведению сыворотки добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты реакции непрямой гемагглютинации учитывают по характеру осадка эритроцитов, образовавшегося на дне пробирки. Положительным считают результат реакции, при котором эритроциты равномерно покрывают все дно пробирки. При отрицательной реакции эритроциты в виде маленького диска или «пуговки» располагаются в центре дна пробирки.

126. Реакция связывания комплемента, методы постановки, механизм и использование ее в бактериологии

Реакция связывания комплемента основана на способности комплемента полностью или частично адсорбироваться на комплексе антиген+антитело. Адсорбция комплемента на комплексе антиген+антитело визуально не проявляется, т.е. видимого комплекса не образует. Для того, чтобы установить произошла адсорбция комплемента или он остался свободным, в реакцию вводится вторая система – индикаторная, гемолитическая. Она состоит из антигена (эритроцитов барана) и антител (гемолитическая сыворотка). Если комплемента в растворе нет, так как он адсорбировался на комплексе антиген+антитело в первой части реакции, гемолиза во второй части реакции не будет, эритроциты осядут на дно пробирки, реакция положительная. Если же комплемент остался в растворе, так как нет взаимодействия между антигеном и антителами в первой части реакции, то наступает гемолиз эритроцитов, образуется «лаковая кровь», реакция отрицательная.

РСК характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью. Она может быть применена для диагностики почти всех инфекционных заболеваний, как для обнаружения антигена, так и для определения антител. Сложность постановки реакции обусловлена количеством вводимых компонентов, необходимостью определять точные количественные соотношения.

1. Исследуемая или свежее взятая иммунная сыворотка перед опытом подвергается прогреванию при 56°С в течение 30 мин для инактивации, т.е. разрушения собственного комплемента. После инактивации сыворотку разводят 1:5.

2. Антиген готовят или из культур микробов или органов инфицированного или здорового животного. Антиген титруют и определяют то его количество, при котором отсутствует тормозящее на комплемент действие.

3. Комплемент титруют и определяют его рабочую дозу. Рабочая доза комплемента – это количество комплемента, увеличенное против титра на 25-30%. Это необходимо потому, что активность комплемента может быть несколько подавлена другими ингредиентами.

4. Гемолитическая сыворотка титруется, для постановки реакции используют сыворотку, усиленную против титра в 3-4 раза. Например, если титр сыворотки 1:1800, то в реакции применяют разведение 1:600.

5. Эритроциты барана получают из стерильно взятой дефибринированой крови, их отмывают, центрифугируя трижды с новыми порциями физиологического раствора, а потом готовят 3% взвесь.

Из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки готовят гемолитическую систему, смешивая равные объемы сыворотки и эритроцитов.

Только после подготовки всех компонентов ставят основной опят РСК.