123. Реакция преципитации в геле для определения токсигенности микроорганизмов, механизм, методы постановки.

Реакция преципитации (РП) - это формирова­ние и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количес­твах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в геле, а другой — антиген — наслаивается на первый в виде раствора.

Антиген, диффундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хорошо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще более простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий проводить прямое сравнение различных антигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследовании перекрестных реакций.

Д ля постановки реакции по Оухтерлоню используют 1%-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе, который разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5—6 мм — одна в центре чашки, 4—5 — по окружности на расстоянии 1—2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагностическую преципитирующую сыворотку, а в периферические — раствор гомологичного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной температуре.

Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со­здаются их эквивалентные концентрации, образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, идущие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких антигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных.

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектрофорез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического разделения.

Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагностическим методом.

124. Реакция термопреципитации, механизм, методы постановки, практическое применение.

Асколи реакция — реакция преципитации (термопреципитации) для обнаружения возбудителя сибирской язвы или его антигена в различных субстратах (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.). Из исследуемого материала готовят путем кипячения в течение 5—45 мин. вытяжку в изотоническом растворе хлорида натрия или экстрагируют антиген 0,5% карболовой или уксусной кислотой в изотоническом растворе хлорида натрия. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр или асбестовую вату или центрифугируют при 1000—3000 об/мин. В узкую пробирку для преципитации наливают иммунную преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку и осторожно наслаивают на нее испытуемый экстракт. В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична. С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Асколи реакция (A. Ascoli) — диагностическая реакция преципитации, используемая для диагностики сибирской язвы. Заключается в обнаружении в исследуемом материале термостабильного сибиреязвенного антигена при помощи преципитирующей сибиреязвенной сыворотки. Кусочки органов, шкуры, кожу, шерсть павших животных, иногда мясо, колбасу и молочные продукты, вытяжки из земли зараженных пастбищ и скотомогильников, фураж измельчают, заливают тройным объемом 0,5% раствора 80% уксусной кислоты в физиологическом растворе NaCl и экстрагируют в течение 10—15 мин. в аппарате Коха или автоклаве при t° 110°. Экстракт нейтрализуют, фильтруют до полной прозрачности через плотный бумажный фильтр или прокаленную асбестовую вату. Присутствие сибиреязвенного антигена выявляют наслоением экстракта оттянутой пастеровской пипеткой на преципитирующую сыворотку в узких пробирках в объеме 0,5 мл. Удобно пользоваться специальными пробирками Асколи (рис.). При положительной реакции на границе между сывороткой и экстрактом немедленно или через 5 — 10 мин. появляется кольцеобразное помутнение, становящееся все более интенсивным. Полученные результаты проверяются контрольными пробами (см. табл.).

№ пробирки (пробы)	Содержимое пробирки
1	Преципитирующая сыворотка + экстракт из исследуемого материала
2	Преципитирующая сыворотка + экстракт из селезенки заведомо сибиреязвенного животного
3	Преципитирующая сыворотка + экстракт из агаровой культуры бацилл сибирской язвы
4	Преципитирующая сыворотка + экстракт из материала, взятого от здорового животного
5	Преципитирующая сыворотка + физиологический раствор NaCl
6	Нормальная сыворотка + экстракт из исследуемого материала
7	Нормальная сыворотка + экстракт из селезенки заведомо сибиреязвенного животного
8	Нормальная сыворотка + физиологический раствор NaCl

В пробирках № 4, 5, б и 7 кольца помутнения отсутствуют. А. р. можно ставить по сокращенной схеме: пробы 1, 2, 5 и 6.

Прибор для реакции Асколи: 1 — воронка; 2 — фильтр; 3 — капиллярная трубка; 4 — экстракт; 5— кольцо преципитации; 6 — сыворотка.