137. Реакция торможения гемагглютинации, реакция торможения гемадсорбции. Практическое применение, методы постановки.

РЗГА (РТГА) — высокоспецифическая серологическая реак­ция, позволяющая решить следующие задачи: определить титр антител к гемагглютинирующему вирусу в сыворотке; идентифи­цировать неизвестный гемагглютинирующий вирус по известней сыворотке; установить степень антигенного родства двух гемагглютинирующих вирусов. РЗГА широко используют для ретро­спективной диагностики некоторых вирусных инфекций (грипп, парагрипп КРС, вирусный аборт овец и др.). Для этого использу­ют парные пробы сывороток, взятые с интервалом в 2...3 недели, и по приросту титра антител в 4 и более раз определяют заболева­ние.

Достоинства РЗГА: простота техники постановки, быстрота ответа, не требуется стерильной работы, специфичность, дешевиз­на. Недостаток — РЗГА возможна только с гемагглютинирующими вирусами.

Сущность РЗГА заключается в том, что при взаимодействии противовирусной иммунной сыворотки с соответствующими штаммами вируса происходит задержка (торможение) гемагглютинирующей способности вируса. На результат РЗГА влияют неспецифические ингибиторы гемагглютинации, содержащиеся в сыворотках крови. Они обла­дают способностью вступать в связь с вирусами и тормозить гемагглютинацию. С целью ликвидации отрицательного влияния ингибиторов на ход реакции их необходимо разрушить (удалить). Для этого используют несколько методов.

Компоненты РЗГА: исследуемый вируссодержащий материал; диагностическая иммунная сыворот­ка; 1%-ная взвесь эритроцитов; 2-й вариант— исследуемая сыво­ротка крови; стандартный антиген (вирусный диагностикум); 1%-ная взвесь эритроцитов.

При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жидкости организма (сыворотки крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задерживать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, то есть сыворотка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некоторых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - термостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обнаруживаются в (бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они мешают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сыворотки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ингибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в а-фракциях глобулина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вирусонейтрализующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные ингибиторы из сыворотки крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры вибриона холеры или перийодатом калия. Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести титра-цию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, то есть разведение в 4 раза меньше, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16. Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удаления термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при температуре 56 -65° С в зависимости от вида животных Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в первой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него 2-кратные разведения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведению сыворотки переносят во второй ряд пробирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встряхиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате, после чего в каждую пробирку вносят по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, пробирки после этого встряхивают и вновь выдерживаю г смесь в комнате 30-60 минут.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГад).

Ее применяют для обнаружения, идентификации и типизации вирусов в зара­женной культуре клеток.

Суть ее состоит в том, что антитела им­мунной сыворотки, взаимодействуя с антигеном гемагглютинирующих вирусов, размножающихся в культуре клеток, экранируют их, и в результате адсорбция эритроцитов на поверх­ности зараженных клеток не наблюдается.

Компоненты реакции:1) инфицированная и неинфицированная гемагглютинирующим вирусом культура клеток в пробирках; 2) Диагностическая противовирусная сыворотка; 3) 0,4%-ная взвесь эритроцитов кур.

Техника постановки. Из пробирок с культурой клеток сли­вают питательную среду, отмывают клетки от ее белковых ком­понентов, добавляя в пробирки 2-3 мл раствора Хенкса. После 1...2 мин экспозиции раствор Хенкса удаляют. Затем в каждую опытную и контрольную пробирки вносят по 0,2 мл диагностиче­ской сыворотки. Пробирки оставляют в наклонном положении, полосой вверх, и выдерживают при комнатной температуре 15...20 мин. Затем добавляют по 0,2 мл 0,4%-ной взвеси эритро­цитов и снова оставляют на 3...5 мин в наклонном положении при комнатной температуре. В дальнейшем пробирки осторожно вра­щают 5-10 раз с целью ресуспендирования осевших, но не адсор­бировавшихся эритроцитов.