РАЗМЕР ГЕНОМОВ, ЕМКОСТЬ ВЕКТОРОВ И
ПРЕДСТАВИТЕЛЬНОСТЬ БИБЛИОТЕК
Емкость типичного плазмидного вектора около 5000-
6000 пн.
Количество клонов в представительной генетический
библиотеке:
p – вероятность присутствия последовательно x – средний размер вставки
y – размер гаплоидного генома
То есть для создания представительной библиотеки
геном надоСЛЕДОВАперекрытьТЕЛЬНОне менее: 3 раз.
Геном |
Размер, тнп |
Клонов |
Чашек |
|
Фаг М13 |
7,5 |
тпн |
5 |
1 |
Фаг |
45 |
тпн |
27 |
1 |
E.coli |
4 000 |
тпн |
2400 |
3 |
Человек |
3 000 000 |
тпн |
1 800 000 |
2 000 |
ВЕКТОРЫ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ
КРУПНЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК В КЛЕТКАХ E.
Векторы наcoliоснове ДНК фага λ
головка
хвостовой
отросток
Фаговые частицы
Фаг λ (фаг лямбда) |
|
— умеренный |
|
бактериофаг, |
ДНК фага λ – 48,5 тпн |
который заражает |
Литический и лизогенный пути развития
фага λ
Литический циклЛизогенный цикл
Репликация ДНК фага λ
3’
5’
3’ 5’
праймер
3’
5’
Репликация по типу катящегося кольца
COS-сайт
---GGGGCGGCGACCTC---
---CCCCGCCGCTGGAG---
Векторы замещения на
основе фага λ
Геном фага λ
|
Гены |
Cos L Левое плечо |
лизогенного |
пути |
Правое |
Cos R |
плечо |
|
Гены, белковые продукты которых необходимы для формирования капсидов и упаковки в них фаговой ДНК
Гены отвечающие за репликацию фаговой ДНК и лизис клеток
Вектор замещения
полилинкер
Фрагмент
чужеродной
ДНК 15-24 тпн
Эффективно упаковываются в фаговую частицу ДНК размером 38-51 тпн. Ограничение по размеру вставки не позволяет клонировать целиком, например, некоторые гены животных, имеющих большие размеры в силу их экзон-интронной организации. Например, ген
дигидрофтолатредуктазы мыши – 32 тпн, ген коллагена
Векторы замещения на основе фага λ
Негативные колонии бактериофагов T4, T3 и T7 (фаговые бляшки)
Космиды
КОСМИДА = COS-САЙТ + ПЛАЗМИДА
Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага λ (Cos-сайт), обеспечивающий упаковку этой ДНК в фаговую частицу.
AbR
Cos
рестрикция
|
MC S |
+ |
Ori |
|
лигрование
Фрагмент ДНК 40 тпн
45 тпн
упаковка in vitro
Космиды |
тупые концы |
|
|
|
|
Фазмиды |
|
ФАЗМИДА = ФАГ + ПЛАЗМИДА |
||
Фазмиды (фагмиды) – это векторы, являющиеся |
|||
гибридом между фагом и плазмидой и способные |
|||
после встраивания чужеродной ДНК существовать и |
|||
как фаг, и как плазмида. |
|||
|
|
|
Размер pMYF131 таков, что она |
Ori |
AbR |
|
не может эффективно |
|
|
|
упаковываться в фаговые |
плазмида |
|
частицы. Упаковка становится |
|
|
возможной после встройки |
||
pMYF131 |
чужеродной ДНК. Размер |
||
Для поддержания фазмиды в |
|||
|
33 тпн |
клонируемого фрагмента |
|
|
клетках в виде плазмиды |
||
|
|
|
около 15 тпн. |
|
Cos |
Ori |
используют штаммы E. coli |
|
лизогенные по фагу λ. Такие |
||
|
|
|
|
Часть генома фага λ, |
штаммы продуцируют фаговый |
||
белок-репрессор cI, подавляющий |
|||
содержащая гены |
развитие фага по литическому |
||
литического пути |
|||
Фазмида на |
пути. Для перевода фазмиды в |
||
основе фага λ и |
фаговую форму меняют условия |
||
плазмиды pUC19 |
культивирования (например, |
||