Лекции / ПромБТ_2020 7 Хроматография - методы
.pdfПромышленная БИОТЕХНОЛОГИЯ
Лекция 7
Хроматография - методы
Ерёмин Сергей Владимирович
+7(903)762-40-12, sirer@bk.ru
НОРМАЛЬНОФАЗОВАЯ
ХРОМАТОРАФИЯ
© С. В. Еремин, 2019
Адсорбционная хроматография
Жидко-твердофазная хроматография
Аналит адсорбируется на поверхности сорбента
Взаимодействие слабое – силы Ван-дер-Ваальса, водородные связи, π- π взаимодействия
Сорбенты – силикагель, окись алюминия, силикат магния, модифицированные силикагели, полиамид, целлюлоза и т.д.
Порядок выхода аналитов – сначала неполярные
Сорбент всегда полярнее чем элюент
Разделяет низко- и среднеполярные вещества без заряда
Не разделяет неполярные (например алканы)
Сэтого вида хроматографии все и начиналось. Перепробывали массу разных сорбентов, в результате из неорганики вообще в жидкостной хроматографии остался силикагель, окись алюминия и флоризил (Florisil – силикат магния).
В ВЭЖХ – по сути остался только силикагель. При этом адсорбционная хроматография на не модифицированном силикагеле почти не применяется – плохо воспроизводится, могут быть «хвосты» и т.д.
© С. В. Еремин, 2019 |
3 |
Силы Ван-дер-Ваальса
Ориентационные силы, диполь-дипольное притяжение. Осуществляется
между молекулами, являющимися постоянными диполями или диполем и ионом. Примером может служить HCl. Энергия такого взаимодействия обратно пропорциональна кубу расстояния между диполями.
+ - + - |
+ - + |
Индукционное притяжение (поляризационное притяжение).
Взаимодействие между постоянным диполем (ионом) и наведённым (индуцированным) на неполярной молекуле. Энергия обратно пропорциональна шестой степени расстояния между диполями.
+ - (+)± (-) |
- (+)± (-) |
Дисперсионное притяжение (лондоновские силы, дисперсионные
силы). Обусловлены взаимодействием между мгновенным и наведённым диполем в случае двух нейтральных молекул. Энергия обратно пропорциональна шестой степени расстояния между диполями.
(+)± (-)(+)± (-)
© С. В. Еремин, 2019 |
4 |
Адсорбционная хроматография
Классический сорбент - СИЛИКАГЕЛЬ
•Полярный адсорбент, применяется в режиме НФ ВЭЖХ для разделения веществ низкой и средней полярности
•Достоинства
–хороший химизм поверхности – хорошая сорбция, можно модифицировать
–сильно пористый, большая удельная поверхность
–технологичность - легко получить нужного размера, формы, пористости и относительно дёшево
–механическая стойкость
•Недостатки:
–влияние на структуру поверхности следов воды в элюенте
–силанольные группы проявляют кислотные свойства => сложно разделять основные соединения
–большой разброс сорбционной силы силанольных групп (сильно зависит от чистоты силикагеля, особенно от содержания металлов)
– небольшой диапазон устойчивости pH 2 – 7 |
5 |
© С. В. Еремин, 2019 |
Силикагель – матрица для большинства современных сорбентов
Сферичность
Размер частиц, мкм
3 |
5 |
10 |
Размер пор, А
Площадь поверхности, м2/г
Достоинства
•Легко получить частицы нужного размера, формы, пористости
•Механическая прочность
•OH-группы позволяют достаточно просто и прочно присоединять к силикагелю разнообразные модификаторы
Недостатки
•Химическая активность OH-групп на поверхности (и разброс!)
•pH нестабильность (2-7)
•Влияние воды на адсорбцию
6
© С. В. Еремин, 2019
Адсорбционная хроматография Классический сорбент - СИЛИКАГЕЛЬ
© С. В. Еремин, 2019 |
7 |
Адсорбционная хроматография хорошо разделяет изомеры по полярным группам
© С. В. Еремин, 2019 |
8 |
Адсорбционная хроматография на силикагеле
Разделяет низко- и среднеполярные соединения по типу, количеству и расположению полярных групп.
Сорбент – полярный, элюенты – низко- и среднеполярные. Взаимодействие сорбат-сорбент происходят на поверхности.
Достоинства:
o Чувствительность к пространственному строению молекулы o Большое разнообразие растворителей в качестве элюентов o Относительная дешевизна
Недостатки:
o Плохая воспроизводимость (влияние воды)
o Трудности с разделением оснований (кислые силанольные группы)
oВлияние разброса адсорбционных свойств силанольных групп на форму пиков и их удерживание
o Малая ёмкость сорбента (в основном важно для препаративной ВЭЖХ) o Затруднена работа в градиентных режимах (долгое уравновешивание)
© С. В. Еремин, 2019 |
9 |
Хроматография на силикагеле – влияние воды
Контролировать содержание воды в неполярном растворителе не просто! Наиболее часто используют крайние точки – сухой и насыщенный водой растворитель. Высушивание – это стандартная, хорошо отработанная процедура. Насыщение водой менее воспроизводимо, поскольку зависит от температуры. Далее смешиваем....
Получаем, например, 33% насыщения водой (см. рис.)
© С. В. Еремин, 2019