Лекции / ПромБТ_2020 3 Хроматография - введение
.pdf
Мёртвое время колонки – из хроматограммы
Артефактный пик в начале хроматограммы, соответствующий выходу растворителя пробы.
Особенно характерен для UV детекторов (из-за особенностей аппаратуры детектор может отследить изменение коэффициента преломления).
Часто выглядит как первая производная гаусовой кривой.
В случае наличия в пробе неудерживающихся соединений – мертвое время можно определять как время удерживания такого соединения (или начало большого пика).
Точность определения зависит от того, насколько не удерживается данный аналит.
© С. В. Еремин, 2019 |
41 |
Мёртвое время колонки
Экспериментальное определение мёртвого (нулевого) времени колонки достаточно сложно. Необходимо вводить совершенно не связывающееся с сорбентом вещество, которое можно увидеть на используемом детекторе.
Если детектор UV, то для ОФ можно использовать урацил или нитрат. Для НФ иногда пригоден бензол.
При рефрактометрии ОФ можно использовать D2O, а для НФ алканы с более длинными цепочками, чем в элюенте.
В коммерчески доступных тестовых смесях для различных колонок всегда присутствует компонент с нулевым (с достаточной точностью) временем удерживания.
© С. В. Еремин, 2019 |
42 |
Мёртвый объём колонки
В лабораторный паспорт колонки удобнее вносить не мёртвое время, а мёртвый объем, поскольку могут использоваться разные расходы элюента. Пересчёт при этом тривиален.
0 мл |
= 0 мин |
(мл/мин) |
0 |
мин = |
0 мл |
|
(мл/мин) |
||||||
|
|
|
|
|
Для новой колонки можно сразу рассчитать мёртвый объем по результатам тестовой хроматограммы (фирменной или своей самой первой).
Кроме того, можно воспользоваться приближенными формулами
Для колонки ID 4.6 мм:
0 мл 0.01 (длина колонки мм) ± 10%
Обобщённая формула:
0 мл 0.5 10−3 (мм) (мм)2 ± 10%
Колонка 250*4.6 мм -> V0 ≈ 2.5 мл
© С. В. Еремин, 2019 |
43 |
Фактор удерживания К (коэффициент ёмкости)
К = (tx-t0) / t0 - отношение исправленного времени удерживания к мёртвому времени
Зависит от
•сорбента, элюента, аналита
•температуры (если есть физико-химические взаимодействия.
В эксклюзионной – НЕТ)
Не зависит от
•размеров колонки
•скорости подачи элюента
Имеет смысл только для изократики!
© С. В. Еремин, 2019 |
44 |
Селективность α
α = Kn+1/ Kn - отношение коэффициентов ёмкости двух соседних пиков.
Зависит от
•сорбента, элюента, аналита
•температуры (если есть физико-химические взаимодействия.
В эксклюзионной – НЕТ)
Не зависит от
• |
размеров колонки |
В общем смысле - способность |
|
• |
скорости подачи элюента |
хроматографической системы |
|
разделять некую смесь |
|||
|
|
||
Имеет смысл только для |
аналитов. Под системой здесь |
||
изократики! |
понимается конкретная колонка |
||
и элюент (или метод градиента)
© С. В. Еремин, 2019 |
45 |
Эффективность - число теоретических тарелок
Под эффективностью хроматографической системы понимают её способность препятствовать размыванию пиков. Теория теоретических тарелок основана на допущениях:
1.колонка содержит некое число теоретических тарелок;
2.на каждой тарелке мгновенно достигается равновесие (равновесное отношение доли сорбированного вещества к доле, оставшейся в подвижной фазе), причём до того, как подвижная фаза переместится на следующую тарелку;
3.вводимая проба должна быть малой и обеспечивать линейную изотерму сорбции;
4.все протекающие в колонке процессы рассматриваются как взаимозависимые.
Теоретическая тарелка – это гипотетическая зона, высота которой соответствует достижению равновесия между двумя фазами. Чем больше теоретических тарелок в колонке, чем большее число раз устанавливается равновесие , тем эффективнее колонка. Количественной мерой эффективности колонки служат высота Н, эквивалентная теоретической тарелке, (ВЭТТ), и число теоретических тарелок N.
© С. В. Еремин, 2019 |
46 |
Теория теоретических тарелок
1 шаг |
|
2 шаг |
3 шаг |
|
|||
128 192 128 |
64 |
64 144 |
64 48 |
32 108 |
32 |
36 |
|
|
↓ |
64 48 64 16 |
64 72 64 |
24 |
|||
НФ |
ПФ |
|
|
32 12 32 |
4 |
||
25 |
Содержание в ПФ - 20 шаг |
|
|||||
20 |
|
|
|
|
|
|
|
15 |
|
|
|
|
|
|
|
10 |
|
|
|
|
|
|
|
5 |
|
|
|
|
|
|
|
0
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
|
8 шаг |
|
|
|
|
|
|
13 шаг |
|
|
|
20 шаг |
|
||||||||
1 |
25 |
|
1 |
9 |
|
|
|
|
|
6 |
|
|
2 |
|
1 |
|
|
|
|
|
|
7 |
60 |
|
7 |
21 |
|
|
|
|
|
30 |
|
|
10 |
|
2 |
|
|
6 |
|
|
1 |
21 60 21 20 |
|
2 |
48 |
2 |
15 |
|
3 |
|
|
17 |
|
|
5 |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
35 32 35 10 |
|
6 |
42 |
6 |
14 |
|
4 |
|
|
30 |
|
|
10 |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
35 11 35 |
4 |
|
15 35 |
15 |
12 |
|
5 |
|
|
36 |
|
|
12 |
||||||||
21 |
2 |
|
21 |
1 |
|
|
|
24 14 |
|
24 |
6 |
|
6 |
|
1 |
36 |
|
1 |
12 |
||
7 |
1 |
|
7 |
|
|
|
|
28 |
8 |
|
28 |
3 |
|
7 |
|
6 |
31 |
|
6 |
10 |
|
1 |
|
|
1 |
|
|
|
|
24 |
4 |
|
24 |
1 |
|
8 |
|
12 |
19 12 |
7 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
15 |
2 |
|
15 |
1 |
|
9 |
|
18 |
11 18 |
4 |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
6 |
|
|
6 |
|
|
10 |
|
22 |
4 |
|
22 |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
2 |
|
|
11 |
|
22 |
3 |
|
22 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
1 |
|
|
12 |
|
18 |
|
|
18 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
13 |
|
12 |
|
|
12 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
14 |
|
6 |
|
|
6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
15 |
|
2 |
|
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
16 |
1 |
|
1 |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
17 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Колонка произвольно разделена на 17 теоретических тарелок. На колонку попадает 256 молекул с распределением 1:1 и 256 молекул с распределением 1:3 (ПФ/НФ). При переносе все вещества в ПФ переходят на следующую теоретическую тарелку и перераспределяется в соответствии с правилом 1:1 и 1:3.
© |
|
47 |
С. В. Еремин, 2019 |
Эффективность - число теоретических тарелок
Число теоретических тарелок N – мера эффективности колонки
|
t |
|
N 5.54 |
W |
|
|
||
0.5 |
|
2 |
|
|
|
|
|
|
|
t |
2 |
N 16 |
|
|
|
W
Основная формула, используется в фармакопеях
Высота эквивалентная теоретической тарелке
ВЭТТ |
L |
|
N |
||
|
W0.5 |
h |
|
L |
||
|
Длина сорбента в колонке
t
0.5h
W
0 |
Время |
Эффективность колонки тем выше, чем уже пик при том же времени удерживания
© С. В. Еремин, 2019 |
48 |
Эффективность - число теоретических тарелок
Имеет смысл только в приложении к конкретному аналиту в конкретных условиях (колонка, элюент, скорость потока, температура и т.д.)
Используется для сравнения разных колонок или сравнения тестов одной колонки в разное время. Новую колонку обязательно надо протестировать в условиях, максимально близких к фирменным тестовым. Позволяет сделать вывод о работоспособности и применимости конкретной колонки.
Важный параметр пригодности колонки к работе по данной методике (ГОСТ, МВИ etc.) – e.g. “эффективность колонки, измеренная по пику основного вещества должна быть не меньше ХХХХХХХ т.т. ” (например «не меньше 10000 т.т.»)
При изократическом разделении выходящие позже пики уширяются больше.
© С. В. Еремин, 2019 |
49 |
Эффективность
© С. В. Еремин, 2019 |
50 |