37) Онкогенные вирусы животных. Механизмы онкогенеза.

Онкогенные вирусы – это вирусы, вызывающие образование доброкачественных или злокачественных опухолей у животных. Онкогенные вирусы обнаружены как среди ДНК содержащих вирусов (семейства Poxviridae, Papovaviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Hepadnaviridae), так и РНК – содержащих вирусов (семействоRetroviridae). Вирусные онкогены (V-onc), обычно известные как раковые гены являются генами, которые кодируют белки, вызывающие трансформацию нрмальных клеток в раковые. Онкогены не существенны для репликации вируса, и мутанты, испытывающие их недостаток, реплицируются нормально, не являясь онкогенными. Гены, похожие на вирусные онкогены найдены как в нормальных, так и в раковых клетках. Онкогены, выделенные из раковых клеток называются клеточными онкогенами (C-onc). Подобные гены, обнаруженные в нормальных клетках называются протоонкогенами. Они не имеют вирусного происхождения. Напротив, вирусные онкогены оказались клеточного происхождения. Клеточные онкогены содержат интроны, характерные для эукариотичных генов, тогда как вирусные онкогены - нет. Очевидно, вирусные онкогены, произошли в прошлом от протоонкогенов путем рекомбинации между ретровирусными и клеточными генами. Протоонкогены широко распространены среди позвоночных и многоклеточных - от людей до мух. Они хорошо сохраняются в их геномах; предполагают что они выполняют некоторые существенные функции в нормальных клетках. Было обнаружено, что они кодируют белки, участвующие в регулировании роста клетки и ее дифференцировании. Предполагаемые функции многих онкогенов были идентифицированы. Например, онкоген srcсвязан с тирозин-специфическими протеинкиназами, sis - с фактором роста, продуцируемым тромбоцитами, myc - с ДНК-связанными белками, все они связаны с регулированием нормального роста клетки. Ценный метод для изучения онкогенов - трансфекция. Определенные линии фибробластов мыши, такие как NIH 3T3, могут воспринимать чужую ДНК, включать ее в геном и проявлять ее. Этот метод передачи гена называется «трансфекция». Этим методом ДНК, извлеченная из человеческих опухолевых клеток, преобразовывала 3T3 клетки, и такие гены преобразования оказались идентичными с клеточными онкогенами. Анти-онкогены.В нормальных клетках человека была идентифицирована категория генов, функцией которых оказалось подавление злокачественной трансформации. Они были названы анти-онкогены,ингибиторы опухоли или гены-супрессоры роста. Их прототип – ген ретинобластомы, потеря которого связана с развитием ретинобластомы у детей. Специфические хромосомальные делеции, связанные с определенными типами опухолей человека могут отражать потерю генов-супрессоров опухоли. 38) Определенные количества инфекционных вирусных частиц в исследуемом материале. Метод образования негативных колоний. Метод конечных разведений.

Количество вируса в каком-либо материале определяют по титру вируса в этом материале. Под титром вируса понимают выражение его концентрации в материале. Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие. Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы.

Метод образования негативных колоний - Суть метода заключается в том, что первичное внесение составленной прописи компонентов агарового покрытия обеспечивает рост и созревание полноценных вирионов вируса на фоне разрушения монослоя клеток и выхода зрелого возбудителя в питательную среду на определенные сутки. Внесение вторичного агарового покрытия обеспечивает окрашивание разрушенных вирусом клеток и получение негативных колоний («бляшек») вируса. Важно отметить, что метод титрования по бляшкообразованию негативных колоний в культуре клеток является наиболее чувствительным из всех существующих биологических методов определения активности возбудителей вирусной природы, так как имеет наименьшую ошибку титрования - от 0,1 до 0,5 lg БОЕ. Кроме того, чувствительность метода «бляшкообразования» в 100...1000 раз превосходит чувствительность выявления возбудителя с помощью иммуноферментного анализа и в 10...100 раз чувствительность выявления возбудителя с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции Менее точным является определение титра вируса методом конечных разведений. Последовательно возрастающие разведения (обычно десятикратные) вводят чувствительным животным, в куриные эмбрионы или клеточные культуры. Учитывая результат каждого введения как положительный или отрицательный, определяют наименьшую дозу вируса, способную вызвать определенный эффект (заболевание или гибель животного, появление цитопатических изменений в культуре и т. п.). Практически эту дозу определить трудно, поэтому вычисляют дозу, дающую 50% эффект (ED50). Ее определяют в зависимости от свойств вируса и метода титрования по числу погибших животных (LD50), числу заболевших (ID50), количеству эмбрионов, у которых появились вирусные Гемагглютинины или комплементсвязывающие антигены, по числу клеточных культур, где были выявлены цитопатические изменения или гемадсорбирующая активность. Титр выражают числом ED50 в определенном объеме материала.