Кальций-кальмодулин-зависимое фосфорилирование.
Как уже упоминалось ранее, внешие стимулы способны увеличивать концентрацию внутриклеточного кальция, который запускает ряд событий клеточной дифференцировки. Мобилизация внутриклеточного кальция может действовать на ферменты непосредственно, как, например, на протеинкиназу С. У эукариотических клеток кальций-кал модулирует активности АЦ, ФДЭ, нескольких протеинкиназ и фосфатаз и ферментов гликолиза. Так что кальциевый обмен тесно связан с обменом циклических нуклеотидов. У N.crassa было продемонстрировано ингибирование ФДЭ кальцием в диапазоне концентраций от 10-7 до 10-6М, по-видимому, по кальций-кал механизму, поскольку ингибиторы кальмодулина фторфеназин и хлорпромазин предотвращали это ингибирование. Стоит здесь упомянуть, что наличие этих механизмов, в основносм, доказано in vitro, а in vivo представляется дотаточно сложным.
Кальмодулин-зависимые протеинкиназы, включая многофункциональную протеинкиназу 2 были выделены из S.cerevisiae, N.crassa.,Fusarium oxysporum. Их субстратами могут служить как мембранно связанные, так и цитоскелетные элементы и ферменты. Эти механизмы объясняют, почему одномоментное изменение концентрации кальция могут иметь далеко идущие последствия на клетку. Кальций-кальмодулиновый механизм с помощью фосфорилирования и последующего белкового синтеза участвует в прорастании патогена насекомых Metharizium anisopliae. Прорастание спор сопровождается накоплением кальмодулина на полюсах спор. Формирование ростовой трубки у Candido albicans также связано с фосфорилированием белков. Этот процесс ингибируется антагонистами кальмодулина. У патогена насекомых Zoophtora radicans системы фосфорилирования связаны с формированием аппресориев сопровождаемая увеличением входа кальция.
У S.cerevisiae кальций-кал механизм регулирует формирование почек, образование полюсов веретена в ходе клеточного деления при участии продукта кальмодулинового гена CLS4, являющегося аллелем гена циклина CDC24, а также еще одного кальций-связывающего белка CDC23. Кроме того, нормальное прохождение жизненного цикла связано у дрожжей с протеинкиназой С. Ген РКС был выделен из S.cerevisiae.
САмф как вторичный мессенжер; его роль у грибов.
Важную роль этому мессенжеру приписывают как в питании, так и в морфогенезе, включая диморфизм, однако очень много противоречивых данных на этот счет.
а роль в росте и дифференцировке.
Эта роль сАМФ была выявлена при экзогенном добавлении этого соединения, а также его аналогов и предшественников, а также путем корреляции с изменением его содержания в клетке путем добавления ингибиторов его cинтеза и распада. Ферменты синтеза и распада сАМФ обнаружены у всех грибов. Несмотря на то, что сГМФ обнаруживали у грибов, сведений о его роли в грибном обмене и морфогенезе почти нет. На прошлой лекции мы говорили, что ФДЭ сАМФ ингибируется определенными концентрациями кальция у нейроспоры. Быстрое временное увеличение внутриклеточной концентрации сАМФ коррелировало прорастанием спор у зигомицетов: Mucor rouxi, Ph.blakaesleanus, Pilobolus longipes, и аскоспор у S.cer. В прорастающих спорах M.rouxi повышение внутриклеточной концентрации сАМФ сопровождалось увеличением активности фосфодиэстеразы. Было сделано предположение, что сАМФ-зависимое фосфорилирование было тем механизмом, который отменял сАМФ сигналв ответ на изменение концентрации глюкозы. Некоторые экспериментальные данные показывают, что сАМФ может запускать прорастание спор. Некоторые физические и химические факторы, стимулирующие прорастание увеличиывают концентрацию внутриклеточного сАМФ; прорастание увеличивается с ингибированием внутриклеточной фосфодиэстеразы (изозимы). сАМФ регулирует целый ряд важных ферментов метаболизма, таких как трегалаза и глицерол-3-фосфатаза. Действие глюкозы на клетки, сопровождаемое деполяризацией плазмалеммы и снижением внутриклеточного рН сопровождалось повышением внутриклеточяного сАМФ. Вроде бы было установлено, что сАМФ является положительным эффектором Н+-АТФазы.
Для нормального роста N.crassa требуется достаточно высокая концентрация сАМФ, хотя его влияние на рост может быть и косвенным. Мутантный штамм N.crassa crisp (cr-1) не содержит сАМФ в связи с дефектной аденилатциклазой. У него измененная морфология - нарушена иерархия строения гифы при росте в отсутствии сАМФ. При добавлении экзогенного бромо сАМФ или других его аналогов после длительного лаг-периода происходит частичное восстановление роста. Это указывает на связь аномального фенотипа с низкой концентрацией сАМФ в клетках мутанта. Однако, есть и противоречащие этому данные. Например, супрессорные мутации могут нормализовать фенотип crisp без воздействия на аденилатциклазную активность. В связи с этим был сделан вывод, что хотя сАМФ влияет на развитие клеточную организацию N.crassa, морфологические отклонения его являются непрямыми воздействиями низкой внутриклеточной концентрации сАМФ.
Известно, что инвертазная активность как дикого, так и мутантного штаммов N.crassa увеличивается как результат добавления внеклеточного сАМФ. Это действие сАМФ зависит от целостности клеточной стенки. Таким образом, не исключено, что сАМФ влияет на синтез полисахаридов клеточной стенки.Добавление клеткам видов Mucor липофильного аналога сАМФ N6O2-дибутирил аденозин 3'5'-монофосфатп (dbcAMP) приводила к серьезным морфологическим изменениям, включая расширение гиф, вздутие кончиков, септирование и усиленное ветвление. Добавление экзогенного сАМФ приводило к значительному снижению скорости удлинения гиф у Fusarium graminearum, а также снижению гифальной единицы роста. Это воздействие не задевало мутантного штамма гриба с множественным ветвлением. Следует подчеркнуть, что высокие концентрации сАМФ (10-3М) для достижения морфологического эффекта на грибные гифы связано, по-видимому, с его плохим проникновением в клеткую Более липофильные аналоги, например, dbcAMP, действовали в меньших концентрациях. Как сАМФ, так и сГМФ могут секретироваться в окружающую среду. Предположительная роль этих секретированных нуклеотидов у мицелиальных грибов связана с определением плотности гиф и регуляции внутриклеточной концентрации этих нуклеотидов.
Ингибиторы ферментов синтеза и распада сАМФ также влияют на рост, хотя часто это действие связано и с побочными эффектами. Ингибиторы фермента синтеза сАМФ - аденилатциклазы такие как такие ак атропин и хинидин) снижали уровень сАМФ в клетках. Метилксантины(теофиллин, кофеин, ИБМК) - ингибиторы ФДЭ обычно уеличивают внутриклеточный уровень сАМФ у Penic.notatum, aurobasidium pullulans, Ophiostoma ulmi, C.albicans. У N.crassa они увеличиали способность в ветвлению.
Феномен диморфизма, свойственный некоторым грибам, также часто связывают с изменениями внутриклеточной концентрации сАМФ.У C.albicans увеличение внутриклеточного сАМФ совпадало с формированием ростовых трубок. Этот же процесс можно было стимулировать dbcAMP и теофиллинм. С дугой стороны, есть данные, показывающие стимуляцю того же процесса снижением внутриклеточной концентрации сАМФ C.albicans. Формирование ростовых трубок ингибировалось компонентами, увеличивающими внутриклеточную концентрацию сАМФ и добавлением внеклеточного сАМФ. Такие противоречивые результаты объясняются различными штаммами, взятыми для опыта, а также разными фазами роста. Известно, что у C.albicans больше сАМФ в стационарной фазе роста, чем в логарифмической. Тем не менее переход дрожжи-мицелий у Mucor racemosus и M.rouxi был связан со снижением сАМФ. Увеличение внутриклеточного сАМФ в процессе перехода дрожжи-мицелий характерно для Asp.pullulans, и O.ulmi. У Asp.pullulans добавка аденозина или АМФ приводила к стимуляции формирования ростовых трубок, связанное с формированием сАМФ после входа в клетку. Добавление экзогенного сАМФ (10мМ) или сГМФ приводило к стимуляции клеточного деления и формирование перегородок, что обычно связано с формированием аппресориев у возбудителя ржавчины бобов Uromyces phaseoli. Схожим действием обладали ингибиторы ФДЭ и АЦ, которые стимулировали клеточное деление и формирование аппресориев. Экзогенная сАМФ обладает способностью вызывать формирование склероциев у штаммов Rhiz.solani, неспособных к их образованию. У этого гриба найдены сАМФ-зависимая протеинкиназа. В этом процессе предполагается участие сАМФ как вторичного мессенжера, поскольку гормонально стимулируемое формирование склероциев сопровождалось увеличением внутриклеточной концентрации сАМФ, стимулируемое либо изменением активености АЦ, либо ФДЭ. Максимальное накопление внутриклеточного сАМФ коррелировало с началом формирования склероциев. У Tr.viridae cвет стимулирует конидиообразование. Процесс передачи светового сигнала сопровождается гиперполяризацией плазматической мембраны, как и увеличением внутриклеточного АТФ и увеличением внутриклеточного сАМФ. Последующее снижение сАМФ может быть результатом увеличения активности ФДЭ, как и у N.crassa.
сАМФ-зависимая протеинкиназа (моя схема).
У сАМФ только один хорошо изученный биохимический механизм - связывание и активация сАМФ-зависимой протеинкиназы. Через этот фермент реализуется действие всех гормонов, приводящих к увеличению внутриклеточного сАМФ. После того как регуляторная субъединица цАМФ-зависимой протеинкиназы связывает сАМФ фермент активируется выщеплением каталитической субъединицы. Протеинкиназы обнаружены у нескольких грибов, включая N.crassa. экспериментальные доказательства, полученные на других эукариотических организмах показывают, что если катаболические пути могут регулирооваться с помощью фосфорилирования через сАМФ-зависимую протеинкиназу, ингибирование катаболического пути происходит часто менее прямо посредством ингибирования соответствующей фосфатазы, дефосфорилирующей сайты фосфорилирования других протеинкиназ. В частности, важноб что сАМФ-зависимая протеинкиназа стимулирует фосфатидилинозитол киназу и фосфатидитинозитол-4-фосфат киназу, что приводит в стимуляции других сигнальных молекул - IP3.
Клонировано 2 каталитических субъединицы ПКА у нейроспоры- через ген pkac-1 и
Pkac-2. 2 гена каталитической субъединицы выявлено и у других филаментных грибов.
Фенотип этого мутанта характеризовался ростом в виде колонии , короткими воздушными гифами, ненормальным конидиообразованием в погруженной культуре и повышенной термотолерантностью. Эти данные показывают, что путь передачи сигнала при участии каталитической субъединицы ПКА регулирует формирование воздушных гиф, формирование конидий и рост гиф и их полярностью