G -БЕЛКИ ГРИБОВ. (Borkovich, The Mycota, 1996)

Гетеротримерные G-белки передают и преобразуют сигналы, которые они получают от так называемых серпентинных рецепторов или семейства 7-спиральных рецепторов, таких как адренэргический рецептор, опсин, обонятельные рецепторы, ацетилхолин, соматостатин, брадикинин. Лиганды, которые эти рецепторы связывают включают свет, одоранты, гормоны, ростовые факторы и нейротрансмиттеры.

У грибов G-белки клонированы у S.cerevisiae, Candida albicans. Sch.pombe, D.discoideum.

Цикл g-белков

a субъединица способна связываь как ГДФ, так и ГТФ. Кроме того, она обладает ГТФазной активность и переводит ГТФ в ГДФ и неорганический фосфат. b и g субъединицы крепко ассоциированы друг с другом и, по-видимому, функционируют как единое целое в процессе передачи сигнала. Гетеротример в неактивном состоянии содержит в a

субъединице ГДФ. Связывание лиганда с рецептором приводит к замене ГДФ на ГТФ на a субъединице. Гетеротример G-белка затем диссоциирует на субъединицы - a и bg. В зависимости от системы трансдукции сигнала или a или bg функционируют в дальнейшем. Эффекторами G-белков могут быть сГМФ-фосфодиэстераза, аденилатциклаза, фосфолипазы и ионные каналы. G-белки у высших организмов регулируют такие важные функции как зрение, обоняние, осязание. Они участвуют в синалах, регулирующих развитие эмбрионов и клеточну. пролиферацию. К сожалению, их исследование осложняется наличием большого числа генов, участвующих в экспрессии субъединиц, а также в трудностях мутационного анализа.

Дело в том, что a субъединица содержит 4 семейства, классифицированные по идентичности аминокислотных остатков в белках. Каждое из них содержит от 2х до 5 подсемейств. Представители каждого подсемейства регулируют определенный путь. Основными в семействе являются Gs и Gi представители. В Gs сумействе два подсемейства, одно из которых регулирует кальциевые каналы и аденилатциклазу, а второе - экспрессируется только в тканях нейронов.

Gi cемейство содержит 4 подсемейства, одно из которых представляет трансдуцин, G-белок, участвующий в зрительной рецепции. 3 представителя этого семейства содержат на С-конце остаток цистеина, необходимый для связывания холерного токсина ( consensus sequence for ADP-ribosilation by pertussin toxin). Три представителя этого семейства ингибируют аденилатциклазу, регулируют калиевые каналы, контролируют транспорт пузырьков через аппарат Гольджи.

Чрезмерная экспрессия или мутации генов, транскрибирующих G-белки выявлялась как потеря ростового контроля в культурах животных клеток и приводит к некоторым видам рака.

G-a субъединицы варьируют в размерах от 350 до 380 аминокислотных остатков. G- b субъединицы довольно большие и содержат примерно 340 аминокислотных остатков. Гомология аминокислотного состава примерно 80-90%. G-g cубъединица маленькая, содержит всего 68-75 а-к остатков. Эта субъединица характеризуется большей дивергентностью и % гомологичных а-к в белках составляет 27-75%.

bg димер участвует в передаче сигнала феромона у дрожжей,

регулирует АЦ у млекопитающих,активрует фосфолипазу С и локализованную в нейтрофилах фосфаинозитид-3-киназную активность.

S.cerevisiae - первый микроорганизм, в котором идентифицирован гетеротримерный G-белок. Метод гибридизации гена дрожжевого Ga и

крысиного G-белка впервые идентифицировал дрожжевой белок GPA1.

Затем был выделен аллель этого гена SCG1. Мутации по этим генам приводили к изменению морфологии - увеличению в размерах и отсутствию почкования. Клетки мутантов были похожи на клетки, остановленные на старте клеточного деления. Затем был приведен целый ряд генетических доказательств, что генs GPA1/SCG1 не функционируют в диплооидах.

STE4 и STE18 мутации делали стерильными S.cerevisiae. Клонирование и секвенирование этих генов показало, что они кодируют b и g субъединицы соответственно. У STE4 белка 40-42% гомологии с b

белами животных клеток; STE18 демонстрирует схожесть с g белками млекопитающих - 21-27% гомологии. Мутанты по этим генам полностью дефектны в спаривании и ответ на феромоны. Как GPA1/SCG1 , так и STE4 и STE18 гаплоидспецифичными генами. Белки, кодируемые этими генами являются положительными регуляторами ответа на феромон у S.cerevisiae, в то время как Gpa1/Scg1является негативным регулятором: в его отсутствие путь функционирует конститутивно, приводя к остановке клеточного цикла. После стимуляции феромоном, белок Gpa1/Scg1 меняет GDP на ГТФ и диссоциирует от bg димера. bg

димер запускает каскадный эффектор, кульминацией которого является образование ростка, спаривание и кариогамия.

NEUROSPORA CRASSA

. G-белки и дифференцировка N.crassa

gna-1 ген у N.crassa был идентифицирован первым из мицелиальных грибов. Затем был идентифицирован ген альфа субъединицы G-белка из Coprinus congregatus - cgpa-1 и ген cpg-1 Cryptonectria parasitica. Предсказанные аминокислотные последовательности N.crassa имеют 68,9% гомологии с копринусом и 98,3 % с

G-белком криптонектрии. (Таблица)

Мутант N.crassa c дефектом альфа субъединицы G-белка имеет замедленный рост вегетативного мицелия, особенно ярко проявляющийся на гиперосмотической среде или на целлофановой подложке, что может указывать на связь функционирования

G-белка и регуляцией осмотичности в клетке, в частности, т.е., по-видимому, регуляции танспортных процессов через мембрану.

Штаммы с дефектом альфа субъединицы демонстарируют множественные дефекты в ходе конидообразования: более короткие воздушные гифы, наличие вздутий у воздушных гиф, пониженная зрелость конидий. Под влиянием света количество конидий не увеличивается.

Протоперитеции продуцируют меланин и не развиваются нормально. Никаких способных размножаться спор не формируется.

Тем не менее, азотчувствительность, по-видимому, сохраняется., так как зрелые протоперитеции не образуются на богатой азотом среде.

N.crassa отвечает на всевозможные внешие стимулы такие как свет, голодание, феромоны, растительные ростовые гормоны. По аналогии с дрожжами, она должна иметь G-белки в ответ на феромоны и гетеротримерный G-белок для ответа на cветовой стимул. Гомолог белка gna1 был выявлен у N.crassa. Делеция этого гена приводит к тому, что при культивировании на твердой среде у таких штаммов ниже скорость апикального растяжения гиф,что сильнее проявляется на гиперосмотической среде или на целлофановой подложке. Прирост биомассы у них ниже и свет не влияет на накопление у них биомассы. Штаммы с мутацией по G-белку дефектны в конидиообразовании. Они образуют более короткие воздушные гифы,образуют ненормальные вздутья и сросшиеся макроконидии. В процессе полового цикла штаммы, дефектные по G-белку являются образуют маленькие недоразвитые протоперитеции. После оплодотворения они не увеличиваются в размерах и развиваются нормально, но никаких спор не образуется. Поскольку белок является субстратом для коклюшного токсина, его причисляют к семейству Gi белков.Еще одна субъединица G-a это gna2. М.В. 41,4кДа. В отличие от Gna1 eго функции пока неизвестны. Позднее было показано, что GNA1 и GNA2 белки участвуют в метаболизме сАМФ. Было выявлено, что у мутантов по GNA1 и двойных мутантов gna1/gna2 активность АЦ снижена на 40%. В экстрактах дикого типа Neurospora активность Mg-ATP-аденилат циклазы

ингибироввалась при добавлении антисыворотки к GNA1 белку. Таким образом доказывается прямое взаимодействие GNA1 и аденилат циклазы N.crassa. Морфологические отклонения в имутантных штаммах коррелировали со снижением сАМФ в клетках. ФДЭ активность была понижена в мутантных штаммах по сравнению с диким типом. Таким образом Ga субъединицы по-разному действуют на АЦ и ФДЭ у мутантных штаммов - двойного и дефектного по GNA1. Впоследствие был выделен и еще один ген, кодирующий белок, относящийся к G.-gna3. Этот белок имел 70 и 67% гомолочичных а-к последовательностей с gna1 и gna2 соответственно. У мутанта по этому гену присутствовали белки GNA1 и GNA2 на уровне дикого типа. На твердой питательной среде у мутанта наблюдалось более плотное конидиообразование и ингибировался рост воздушных гиф, но скорость растяжения гиф на задевалась. Уровень сАМФ в мутантах gna3 составляла только 20% от дикого штамма. Эти данные заставляют предполагать возможную роль GNA3 в метаболизме сАМФ у N.crassa.

Ustilago maydis

Cуществует или в дрожжевой форме или в форме филаментов (дикарион). Спаривание, дикарион и филаментная форма определяют вирулентность. Таким образом, спаривание и вирлентность взаимосвязаны. Было показано, что два разных аллеля локуса типа спаривания а1 и а2 кодируют два белка. Один из них напоминает пептидный феромон дрожжей. Другой кодирует семиспиральный рецептор, похожий на известные грибные рецепторы феромона. таким образом,по-видимому, стратегия спаривания у U.maydis такая же, как у других грибов, поэтому предполагается участие G-белков.

из приведенных примеров видно, что в функционировании G-белков много общего с высшими эукариотами.

КАЛЬЦИЙ

Общие свойства:

Кальций - морфоген

локализация его в верхушке и дирижирование событий там. Он только в верхней зоне, так как за ним происходит секвестрирование в эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Снижение кальция дальше связано с тем, что это он не мешает сокращению и растяжению элементов цитоскелета в процессе роста.

Возникновение эндогенных токов - не только электрическое поле, обусловленное движением заряда, но и концентрационный градиент, обеспечиваемый кальцием. Это наиболее выраженный градиент, так как движение кальция внутри клетки ограничено его связыванием с белками и мембранно-связанными пузырьками.

Единственная надежная работа по кальцию была проведена на сапролегнии, где, как и у пыльцевых трубках был выявлен кальциевый градиент Мембранные пузырьки и их использование. Высокий кальций в верхушке, снижается до 10 мкмолей. Гифа растет только при кальции во внешней среде.

Ингибиторы кальция прерывают рост и градиент кальция.

Кальций-связывающий белок кальмодулин находится только в верхушке, но его участие в почковании дрожжей никак не связана с кальцием.но:

30 мин инкубация в бескальциевой среде сохраняет градиент

3 микроэлектродная техника

конститутивный экзоцитоз у дрожжей не связан с перетурбациями внутриклеточного кальция.

кальций как микроэлемент.

Основная функция кальция – передача регуляторных сигналов. Кальций активирует многие катаболические процессы (гликогенолиз, липолиз, протеолиз), а также стимулирует синтез белка, мышечное сокращение и немышечную подвижность, экзоцитоз, ионный транспорт, секрецию нейромедиатров. Молекулярные механизмы действия кальция на многие процессы изучены недостаточно. В частности, неизвестно, каким образом кальций влияет на дифференцировку, пролиферацию и программируемую смерть клетки. Показано, что кальмодулинзависимая протеинкиназа может фосфорилировать факторы транскрипции, а кальретикулин влияет на активность рецепторов глюкокортикоидов в ядре. Известно также, что внутриклеточный кальций стимулирует процессы апоптоза и это действие реализуется через активацию нуклеаз и протеаз, которые разрушают ДНК и хроматин. Отметим также, что подъем концентрации внутриклеточного кальция является необходимым звеном в мейозе клетки. Слияние половых гормонов также сопровождается подъемом уровня кальция.Для образования зиготы необходимо связывание кальция с кальмодулином. Без повышения уровня кальция в клетке митоз останавливается, а калцийзависимое дефосфорилирование белков кальцинейрином переводит клеточный цикл из стадии G0 в G1. Таким образом, ионы кальция контролируют метаболизм, функциональную активность и рост клеток, а также их рождение и смерть. При исследовании влияния кальция, на связывающие его ферменты, следует учитывать:

1. В Са-связывающих белках может быть несколько участков связывания кальция, между которыми проявляется положительная кооперативность. 2. При связывания кальция в структуре белка может увеличиваться число альфа-спиралей и часто на поверхности экспонируются функциональные группы, участвующие во взаимодействии кальций-связывающего белка с так называемыми эффекторными белками. Таким образом, кальций вызывает взаимодействие двух белков, что приводит к изменению их активности и ли локализации в клетке.

Несмотря на то, что роль кальция до сих пор окончательно не выяснена как у грибов, так и у животных клеток ясно, что многие метаболичесrие системы зависят от его внутриклеточных флуктуаций. Очень трудно получить свободную от кальция среду, он всегда есть в примесях. Kальций обнаруживается во всех грибных клетках и играет определенную роль во всех основных жизненных событиях - росте, дифференцировке и спороношении (таблица). Считается, что кальций передает сигналы с клеточной поверхности, т.е. химические, физические и электрические сигналы. Поскольку кальций регулирует разнообразные внутриклеточные процессы и некоторые из них могут происходить одновременно, это, естественно, осложняет ситуацию при попытке исследования его роли в процессе передачи сигнала. Хотя основные аспекты кальциевой регуляции,по-видимому, схожи у животных и грибов, грибные клетки обладают определенными особенностями в отношении регуляции внутриклеточного кальция. Поскольку кальций является токсичным соединением ввиду его способности образовывать нерастворимые фосфаты с АТФ, АДФ и АМФ, грибные клетки обладают определенными механизмами для снижения концентрации внутриклеточного кальция. Низкие концентрации кальция определяют его свойства как вторичного мессенжера и флуктуации примерно на два порядка с 10-7М до 10-5 М сильно не сдвигают внутриклеточный ионный баланс и обеспечивают селективное связывание кальция определенными субстратами. Чтобы понять роль кальция как вторичного посредника нужно вначале обратиться к его регуляции как системами, транспортирующими кальций внутрь клетки, так и внутриклеточными системами компартментализации-секвестрирования.

Регуляция внутриклеточного кальция. Временное повышение внутриклеточной концентрации кальция является триггером многих внутриклеточных процессов, поэтому важно рассмотреть механизмы, которые обеспечивают это повышение, а также те, которые не допускают кальциевой интоксикации и снижают его концентрацию клетке

1. Транспорт кальция. Кальций обычно транспортируется двумя путями - с помощью кальциевых каналов и с помощью вторичных транспортеров, обычно использующих энергию электрохимического градиента протонов на плазматической и вакуолярной мембранах. В состоянии покоя в грибных клетках концентрация свободного кальция составляет 100-300 нм. Трансмембранный электрохимический кальциевый градиент (DmСа2+) необходим для передачи сигнала. Кальций или компартментализуется различными органеллами или связывается внутриклеточными кальций связывающими белками, которых известно более 20. Наиболее хорошо изучен кальмодулин.

2. Вход кальция в клетку. В мембранах клетки функционируют сложно организованные белковые структуры, обеспечивающие вход кальция в цитоплазму по градиенту его концентрации. Это каналы, открытие которых регулируется либо связыванием лиганда, либо потенциалом на мембране. Кроме того, на мембране имеются селективные системы активного транспорта кальция против градиента его концентрации, использующие для этого либо энергию АТФ (Са-насос), либо градиенты других ионов. Таким механизмом является выявленный у нейроспоры Са-Н-антипортер. Вход кальция в грибную клетку метаболически зависим и его измерение часто затруднено тем, что в вакуолях существует энергозависимый процесс аккумуляции кальция.

Вход кальция через потенциал-зависимые каналы у S.cerevisiae стимулируется глюкозой. Процесс внутриклеточного закисления, наступающий при этом, также влияет на процесс входа кальция в клетку.

В протопластах Uromyces appendiculatus найдены механочувствительные кальциевые каналы, пропускающие ряд катионов, включая кальций. Такие каналы я уже упоминала в верхушечной клетке оомицета Saprolegnia ferax, которые способствуют росту верхушки гиф путем создания кальциевого градиента.

3. Выход кальция. Ранее предполагалось наличие Са2+/H+ антипорта в клетках грибов. Теперь все больше доказательств собирается в пользу наличия кальциевой АТФазы на мембране грибной клетки. Однако пока еще нет экспериментов по реконструкции этого фермента, вопрос остается спорным.

4. Компартментализация. Вакуоли представляются основным хранилищем кальция у грибов наряду с марганцем и цинком. Определяющим транспортером является кальций/H+ антипорт, использующий энергию электрохимического градиента протонов Н+-АТФазы тонопласта. АТФаза работает таким образом, что выбрасывает протоны внутрь тонопласта и создает на мембране градиент рН от 0,5 до 1,5 единиц. Такое изменение сильно влияет и на рН цитозоля. Способность к компартментализации в вакуоле дает возможность грибам существовать на среде с высокой концентрацией кальция до 100 мМ CaCl2. Накапливается кальций внутри,в основном в виде кальций полифосфатов - полимеров ортофосфорной кислоты, образующих комплексы с кальцием. Мутанты S.cerevisiae дефектные по транспорту кальция в вакуоли имели увеличенную внутриклеточную концентрацию кальция и метаболические сдвиги. Транспорт из вакуолей у грибов плохо изучен. У растений есть надежные доказательства транспорта кальция из тонопласта за счет ионного канала, регулируемого за счет инозитол 1,4,5 трифосфата. Такие же каналы были выявлены в Neurospora. У дрожжей S.carlsbergensis приводили доказательства наличия Н+-пирофосфатазы которая выбрасвает кальций.

МИТОХОНДРИИ Раньше считалось, что митохондрии играют существенную роль в секвестрировании кальция у грибов. Однако в дальнейшем выяснилось, что кальций внутри митохондрий нужен скорее в процессах метаболизма, например, для регуляции активности дегидрогеназ. Мутанты S.cerevisiae, чувствительные к кальцию, не имели никаких митохондриальных дефектов. Хотя у Ph.blakaesleanus было показно, что кальций распределяется в спорангиофорах как в вакуолях, так в митохондриях и эндорлазматическом ретикулуме и все эти органеллы имеют значение для модуляции его внутриклеточной концентрации. Митохондриальная система удаления кальция из цитоплазмы имеет значение только при крайне высоком уровне кальция в цитоплазме – 10-5М и выше, что набюдается при некоторых патологиях и других критических ситуациях в жизни клетки(перекисное кисление липидов при окислительном стремме, механическое повреждение мембраны.)

Эндоплазматичаский ретикулум. В эндоплазматическом ретиулуме

Sch.pombe cодержится Са2+ АТФаза, похожая по свойствам с СА2+-АТФазой саркоплазматического ретикулума животной клетки. Наличие кальция в эндоплазматическом ретикулум было показано и в кончике гифы у N.crassa.

Взаимодействие между кальциевыми каналами внешней и внутренней мембран, Са насосами, а также Са-связывающими белками, локализованными как в мембранах, так и в цитоплазме клетки, приводит к так называемым осцилляциям кальция, то есть к периодическим флуктуациям его концентрации в цитоплазме. В невозбудимых клетках основным фактором осцилляций является IP3, который образуется из ТФИ при активации фосфолипазы С гормонами и факторами роста. (КАРТИНКА!). ИФ3 способен диффундировать из мембраны до ЭР за десятки секунд. Количество и концентрация ИФ3 достаточно высоки, чтобы оккупировать все молекулы соответствующих рецепторов, однако выход кальция происходит только в так называемых горячих точках. Это участки переменной локализации в клетке, возникающие как пузырьки в закипающей воде за счет высокой локальной концентрации кальция, ИФ3 или его рецептора. В гашении горячих точек участвуют также кальциевые насосы, транспортирующие кальций в ретикулум или межклеточное пространство. Интересно, что во многих типах клеток волна кальциевой осцилляции распространяется от клеточного ядра и может приобретать форму сфер или сложных спиралей. В некоторых клетках (сердце, мозг) кальциевые осцилляции, возникшие в одной клетке, могут вызывать осцилляции в соседних клетках, причем с той же частотой, что и в клетке, инициировавшей этот процесс. По-видимому, в этих тканях кальциевая волна может распространяться через межклеточные контакты, обладающие высокой ионной проводимостью. Обычно уровень кальция в клетке меняется от 10^-7 до 5х10^-7М, а частота от одного колебания в мин до нескольких колебаний в сек. Кальций-зависимые эффекты гормонов и факторов роста оказываются прямо пропорциональными частоте флуктуаций цитоплазматического кальция. При высокой частоте осцилляций увеличивается вероятность насыщения кальцием Са-связывающих белков. Диссоциация кальция из высокоаффинных участков его связывания происходит за минуты, а кальций в цитоплазме осциллирует быстрее, поэтому кальций связывающие белки воспринимают частотную информацию и. подобно преобразователям переменного тока в постоянный, преобразуют ее в медленно развивающееся (за минуты или часы) изменение метаболизма, морфологии или функционального состояния клетки.

Кальцийсвязывающие белки Таким образом низкая концентрация кальция в клетке обеспечивается разными способами . Один из них является наличие кальций-связывающих белков. Часть из кальций связывающих белков у грибов несет энзиматические функции, как, например, кальций-фосфолипидзависимая протеинкиназа С у N.crassa. Белки цитоскелета обладают способностью связывать внутриклеточный кальций. Однако наиболее хорошо изученным кальций связывающим белком является кальмодулин.-модулирующий кальций. Этот белок обнаружен у многих грибов и дрожжей. Изменение конформации кальмодулина при связывании кальция способствует его взаимодействию с белками-мишенями - протеинкиназами, фосфатазами, аденилат-циклазой, ФДЭ и Са2+-АТФазой. Комплекс кальций-кальмодулин имеет на 4 порядка большее сродство к ферменту-мишени, чем кальций или кальмодулин по отдельности. Триггером активации реакций с этим комплексом является повышение внутриклеточного кальция. Вторым триггером этих реакций может быть повышение кальмодулина при неизменной концентрации кальция. Это более медленная и энергетически невыгодная стимуляция, ведущая к замедленной регуляции клеточного ответа. Кальмодулин низкомолекулярный белок. (мв 16-17 кДа.), термостабильный кислый белок. Грибной кальмодулин демонстрирует 60-80% гомологии аминокислотных остатков с бычьим кальмодулином и представляет собой довольно гетерогеннкую группу белков у разных грибов. Он необходим для таких функций грибной клетки как пролиферация, контроль клеточного цикла, клеточное деление. Гены кальмодулина были выделены из S.cerev., Sch.pombe, Asp.nidulans. Разрыв гена приводит к прекращению роста грибов. Перед клеточным делением количество кальмодулина у дрожжей возрастает вдвое, демонстрируя его необходимость в этом процессе. Роль его в митозе дрожжей подтверждается тем фактом, что если убрать кальций из среды, клеточный цикл останавливается на стадии G2/M, из-за влияния на кальмодулин изменением концентрации кальция. У растущих дрожжей кальций включается в процессы роста почек, цитокинез и расхождение хромосом. Кальмодулин распространен внутри грибной клетки ассиметрично в процессе клеточного деления и локализуется в месте образования почки. Такая локализация не мешает активному связыванию кальция. Распад кальмодулина приводит к делокализации актина, указывая на связь между этими белками. Было показано, что кальмодулин накапливается у дрожжей на кончиков shmoo клеток (отростков) при действии альфа фактора. Таким образом участвуя в поляризованном росте. Однако мутанты дрожжей, у которых кальмодулин был неспособен связывать кальций сохраняли хорошую скорость роста, что говорит о том, что кальмодулин способен функционировать и без связывания кальция. Возможно, кальмодулин требуется какому-то фермента для интенсификации активности как недостающая субъединица .