1. Методы осаждения вирусов химическими веществами:

1. Осаждение метанолом, который добавляют к охлажденной ви- руссодержащей жидкости при низких температурах до конечной кон­центрации 35%. Смесь оставляют на 4 часа при 4°С, центрифугируют для осаждения, а затем растворяют в буферном растворе. Оптималь­ную концентрацию спирта определяют в предварительных опытах и она колеблется от 15 до 35%.

2. Осаждение вирусов в изоэлектрической точке. Изоэлектрические точки большинства известных вирусов лежат в зоне рН 3,5-6,5, т. к. ви­русные белки в основном кислые. При этом методе к вируссодержа- щей жидкости медленно с постоянным помешиванием добавляют 1 н ра­створ соляной кислоты при температуре +4°С и доводят рН среды до изоэлектрической точки данного вируса, смесь выдерживают на холо­де несколько часов, затем центрифугируют для осаждения 20-30 ми­нут при 3-4 тыс. оборотов, надосадочную жидкость сливают и осадок разводят в слабощелочном буфере.

3. Осаждение солями. Для осаждения вирусов обычно используют неорганические соли цинка, марганца, кобальта, бария и магния. Хо­рошо вирусы агрегируются и выпадают в осадок при воздействии сер­нокислых солей магния, натрия и аммония. Наиболее широко приме­няется сульфат аммония.

К охлажденной вируссодержащей суспензии добавляют насыщен­ный раствор сернокислого аммония до определенной концентрации (15-35%), перемешивают и оставляют на холоде на 1-16 часов, для уда­ления осадка центрифугируют и осадок растворяют в фосфатном бу­фере в объеме 1/10 от исходного объема суспензии.

4. Осаждение полиэтиленгликолем. В вируссодержащую суспен­зию при рН 7,4 добавляют полиэтиленгликоль до концентрации 7,5%, контактируют в холодильнике, центрифугируют для осаждения и за­тем осадок ресуспензируют в буферном растворе.

2. Метод Ильенко: с использованием хлороформа или эфира. Ме­тод пригоден для очистки вирусов от липидов и липоидов и применя­ется чаще для очистки нейротропных вирусов от мозговой ткани. Из мозговой ткани готовят суспензию и к ней добавляют равный объем хлороформа или эфира, закрывают резиновой пробкой и тщательно встряхивают для хорошего перемешивания, выдерживают 2 часа в хо­лодильнике при +4°С и центрифугируют 20-30 минут при 3-4 тыс. обо­ротов в минуту. Если был добавлен эфир, вируссодержащий материал будет снизу, выше мозговая ткань и лигшды, вверху эфир. При добав­лении хлороформа он будет находиться внизу, выше мозговая ткань и в верхнем слое вируссодержащая жидкость. Применяют этот метод для очистки только тех вирусов, которые являются нечувствительными к хлороформу и эфиру.

в) биологические методы

1. Для очистки вируссодержащей жидкости от бактерий широко применяют добавление к суспензии антибиотиков пенициллина и стрептомицина, от плесней и дрожжей добавляют нистатин.

2. Культивирование вирусов в злокачественных опухолях (осцит- карцинома, саркома Крокера и др.), на куриных эмбрионах и в культу­рах тканей позволяет очистить и накопить вирусы.

Серологическая диагностика вирусных болезней

Для диагностики вирусных болезней в ветеринарной практике при­меняются различные серологические реакции: РСК, РЗГА, РН (реак­ция нейтрализации вируса), РДП (реакция диффузной преципитации) и другие. В основе их лежит способность антител, находящихся в сы­воротке крови, реагировать со специфическими антигенами вирусов. Следовательно, для постановки любой серологической реакции обя­зательными компонентами являются антиген и антитело.

Антитела образуются в организме животных клетками лимфоид- ной ткани (В-лимфоцитами) на введение (при иммунизации) или по­падание (при заражении) какого-либо антигена и накапливаются, как в депо, в сыворотке крови. Антитела выполняют защитную роль, как фактор специфической защиты организма.

По химической природе антитела являются белками, специфичес­кими иммунными глобулинами (иммуноглобулины пяти классов) и содержатся преимущественно в гамма-глобулиновой фракции крови.

В зависимости от вида серологических реакций антитела, участву­ющие в них, называют по разному: в РСК - комплементсвязывающие; в РДП - преципитирующие (преципитины); в РН - вируснейтрализующие антитела; в РЗГА - антигемагглютицины и т.д.

Такое разнообразие антител объясняется различием антигенной структуры вирусов. В составе вирусов содержатся различные антиге­ны, которые стимулируют выработку различных по действию антител.

Антигены - это вещества белковой природы, которые при попадании (или введении) в организм парэнтеральным путем (т. е. минуя желудоч­но-кишечный тракт) вызывают образование антител. С образовавши­мися антителами антигены могут вступать в реакцию (специфическое взаимодействие) как в организме животного, так и вне организма (ин вит­ро, в пробирке), что и используется при постановке реакций. В результате такого взаимодействия происходит обезвреживание свойств антигена (вируса). Так, обезвреживание инфекционных свойств антигена (ви­руса) мы устанавливаем в реакции нейтрализации вируса, гемагглю- тинирующие свойства - в реакции задержки (торможения) гемагглю- тинации и т. д.

Вирусы содержат различные белки, отличающиеся друг от друга не только по строению, физико-биохимическим свойствам, но и по ан- тигенности. По белковому составу, а, следовательно, и по антигеннос- ти вирусы не одинаковы, что и используется при их серологической дифференциации и идентификации. Так, вирус гриппа имеет 5 раз­ных антигенов: нейраминидазу, гемагглютинин, S-антиген и два мало­изученных антигена. Вирус ящура содержит ^антигена, вирус чумы КРС имеет преципитирующий и комплементсвязывающий антигены.

В зависимости от применяемых серологических реакций антиге­ны, участвующие в них, называются, так же как и антитела, по разному: в РСК - комплементсвязывающий антиген, в РН - антиген, вызываю­щий образование вируснейтрализующих антител, в РДП - преципи­тирующий антиген (преципитиноген), в РЗГА и РГА - гемагглютини- рующий антиген (гемагглютинин) и т.д.

Антигены у различных групп вирусов строго специфичны и могут реагировать только с соответствующими антителами. У вирусов, вхо­дящих в одну группу, некоторые антигены могут быть общими для всей группы (группоспецифические), другие антигены являются специфич­ными только для одного какого-либо штамма данной группы (штам- мо-специфические).

При постановке серологических реакций выявление антител или антигена основано на принципе специфичности их взаимодействия, т. е. антигены взаимодействуют только со специфическими антителами и наоборот. Поэтому в серологических реакциях один из этих компо­нентов (антиген-вирус, или антитело) должен быть заранее известным и по нему определяют второй (неизвестный в реакции) компонент. В связи с этим серологические реакции могут быть поставлены в двух вариантах:

а) с известными иммунными или гипериммунными сыворотками (диагностические сыворотки) для определения (идентификации и ти­пизации) вирусов, выделенных из исследуемого патологического ма­териала;

б) с известными антигенами (диагностикумами) для обнаружения антител и определения их количества в присылаемых для исследова­ния сыворотках крови, взятых от больных и переболевших животных. С помощью серологических реакций можно установить сроки появле­ния в крови антител у вакцинированных животных и выявить дина­мику антителообразования.

В качестве антигенов при постановке серологических реакций применяют:

а) надосадочную жидкость из суспензий органов, содержащих ви­русы, после многократных замораживаний и размораживаний с пос­ледующим центрифугированием;

б) культуральную жидкость из зараженных культур тканей;

в) материал (суспензия оболочек или куриного эмбриона, жидко­сти из полостей) из зараженных куриных эмбрионов;

г) содержимое афт, пустул, истечения и смывы из носа и других полостей, жидкости из полостей организма и т. д.

Антигеном может быть живой (нативный) вирус или обезврежен­ный (инактивированный, убитый) вирус. Иногда для повышения ка­чества и специфичности серологических реакций предварительно про­водят очистку и концентрацию антигена (вируса).

1. РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСА (РН)

Реакция нейтрализации является одной из основных серологичес­ких реакций, широко используется для диагностики различных ви­русных болезней, она наиболее специфична и высоко чувствительна, служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии.

Сущность РН заключается в том, что при вирусных болезнях в крови появляются вируснейтрализующие антитела, которые при взаимодей­ствии с вирусом (при смешивании вируса со специфической сыворот­кой), как в организме, так и вне его (ин витро), способны обезвреживать его инфекционные свойства и вирус теряет инфекционные свойства и способность вызывать заболевание у чувствительных лабораторных животных, куриных эмбрионов, или вызывать ЦПД в культурах тка­ни. Ставят РН на лабораторных животных, куриных эмбрионах или культурах тканей в зависимости от того, какая из этих живых моделей является чувствительной для данного вируса. Обычно используют ту модель, на которой выделяли вирус и к которой вирус уже адаптиро­вался и проявляет четко выраженный инфекционный эффект. Меха­низм реакции до сих пор окончательно не выяснен. Некоторые авторы ее рассматривают как явление, аналогичное воздействие антитоксина на токсин, другие же - как блокаду рецепторов вируса и восприимчи­вых клеток антителами сыворотки.

С помощью РН можно идентифицировать и дифференцировать вы­деленные вирусы, выявлять нарастание титра антител и динамику в сыворотках крови переболевающих и иммунизированных животных. В качестве антигена в этой реакции берут живой (нативный) вирус. Свежевзятые сыворотки перед постановкой РН инактивируют прогре­ванием как и для РСК.

Вирус для постановки РН следует предварительно протитровать, чтобы выявить его предельную активность для данной чувствитель­ной модели. Активность для лабораторных животных и куриных эмб­рионов определяют обычно в ЛД₅₀ и ЭЛД₅₀ (летальных дозах) или ИД₅₍₎, ЭИД₅₀ (инфекционных дозах), а для культуры ткани в ТЦД₅₍₎ (цитопа- тических дозах) - смотри раздел «Титрование вирусов». На этой же чувствительной модели (системе) затем ставят РН.

РН можно ставить в двух вариантах:

1. с постоянной дозой вируса и разными разведениями (дозами) сыворотки. Этот вариант чаще используется для диагностики вирус­ных болезней, определение титра Ат и динамику;

2. с постоянной дозой разведенной или неразведенной сыворотки и разными дозами вируса (готовят разные разведения вируса).

Для постановки реакции в том и другом варианте в пробирки вно­сят в равных объемах вирус и специфическую сыворотку, смесь вы­держивают в контакте 1-2 часа в условиях термостата (37-38°С) или 18 часов в холодильнике при температуре +2°, +4°С. После контакта смесь вводят для заражения в избранную живую систему, чувствитель­ную для данного вируса. В качестве контролей служат аналогичные живые системы, которым вводят вирус без сыворотки, смесь вируса с нормальной (неиммунной) сывороткой и смесь с иммунной сыворот­кой. Результаты реакции учитывают через определенный срок (через 5-12 дней, в зависимости от вида вируса и живой системы) по отсут­ствию гибели животных или куриных эмбрионов и по отсутствию ЦПД в культурах ткани в случае введения смеси вируса со специфической сывороткой.

Преимуществом РН является то, что ее можно выполнять почти со всеми вирусами, кроме АЧС, АБН, лейкоз, ИНАН, и на всех биологи­ческих моделях, использованных для выделения вируса.

Нейтрализующую активность сывороток определяют вычислением индекса нейтрализации. Индекс нейтрализации представляет собой ча­стное от деления титра вируса в смеси с нормальной сывороткой на титр вируса в смеси с иммунной сывороткой и он выражает макси­мальное количество инфекционных или летальных доз, которое нейт­рализуется данной сывороткой по сравнению с контрольным опытом. Определяют индекс нейтрализации по формуле:

ин = тут₂

где Tj - титр вируса в присутствии нормальной сыворотки; Т₂ - титр вируса в присутствии специфической сыворотки.

Например:

Т₁ = 10⁷, Т₂ = 10²

ИН = 10У10² = 10⁵ = 100.000.

Положительной реакцией считают реакцию с индексом нейтрали­зации (ИН) 2 логарифма и более или 100 и более раз в числовом выра­жении. Реакцию с ИН менее 1 логарифма считают отрицательной.

2. РЕАКЦИЯ ДИФФУЗИОННОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ ИЛИ ИММУНОДИФФУЗИИ (РДП, РИД)

РДП (РИД) применяется в настоящее время для диагностики вирусного гепатита плотоядных, бешенства, лейкоза КРС, инфек­ционной анемии лошадей и многих других болезней. По сравнению с другими серологическими реакциями эта реакция наиболее про­ста по технике и довольно специфична по показаниям, но несколь­ко менее чувствительная.

Сущность реакции заключается в том, что специфические антиген и антитело, помещенные на определенном расстоянии друг от друга в агаровом геле, диффундируют в среду и в местах их встречи образуют полосы преципитации, хорошо видимые при нижнем боковом осве­щении на темпом фоне. При несоответствии антигена антителам (в отрицательных случаях) полосы преципитации не образуются.

В РДП участвуют два компонента - антиген и сыворотка (анти­тело), проходит реакция в агаровом геле в присутствии в качестве элек­тролита физиологического раствора хлористого натра.

Для постановки реакции заранее готовят 1%-ный агаровый гель из высоко очищенных сортов агара. Лучше использовать агар Дифко, который в такой концентрации дает прозрачный гель, позволяющий четкой хорошо видеть полосы преципитации. Для приготовления ага­рового геля берут на литр дистиллированной воды 10 г агара Дифко, 8,5 г хлористого натрия и нагревают в кипящей водяной бане до пол­ного расплавления агара. Затем добавляют в качестве консерванта мер- тиолат 0,1 г или кристаллическую карболовую кислоту 5,0 г. В горя­чем виде разливают по флаконам по 50-100 мл, стерилизуют автокла- вированием при 0,8-1 атм. 20 минут (или в кипящей бане 30-40 ми­нут) и хранят под резиновой пробкой до употребления, чтобы не было высыхания среды. Для увеличения контрастности среды иногда добав­ляют метилоранж (5:100.000). Другие сорта агара требуют предвари­тельного их осветления. Для этого вначале готовят из агара 2%-ный раствор на дистиллированной воде, который после расплавления в ки­пящей бане в горячем виде разливают в ванночки толщиной в 1-1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кусочки разме­ром 0,5-1,0 см, которые промывают в течение 2-3 суток проточной во­допроводной водой и затем еще сутки дистиллированной водой, ме­няя ее за это время 3-4 раза. После промывания агар отжимают в мар­ле и вновь расплавляют в кипящей бане и разводят в 2 раза 1,7%-ным раствором хлористого натрия на дистиллированной воде, чтобы ко­нечная концентрация агара была 1%, а хлористого натрия - 0,85%. В горячем виде раствор трижды фильтруют через бумажный фильтр (или ватно-марлевый) и после добавления консервантов разливают по фла­конам и стерилизуют. В расплавленном виде агар должен быть совер­шенно прозрачным. В настоящее время готовый 1%-ный агар для РИД выпускают в наборе с диагностикумами при бешенстве, вирусном ге­патите, лейкозе, ИНАН и других заболеваниях.

Ставят реакцию в чашках Петри или на предметных стеклах в мик­ромодификации. При постановке реакции в чашках Петри отбирают чистые, хорошо мытые чашки с ровным дном. В чашку вносят расплав­ленный в кипящей бане 1%-ный агаровый гель в количестве 25-30 мл с таким расчетом, чтобы слой был 3-4 мм. После застывания агара в нем делают лунки, форма, количество и расположение которых в агаре мо­жет быть различное в зависимости от объема и цели исследования. Ког­да исследуют один антиген к двум сывороткам (или наоборот) гото­вят три лунки. При .диагностике бешенства антиген (суспензия моз­га) исследуют к 4 разведениям антирабической сыворотки (1:2,1:4,1:8, 1:16) и для этого готовят 5 лунок, одну из которых делают в центре, остальные четыре по периферии. При больших объемах исследований лунки часто располагают в форме шестиугольника (одна лунка в цен­тре и шесть по периферии). Таких шестиугольников можно в одной чашке Петри приготовить 6-7 и, следовательно, можно исследовать 36-42 материала. Лунки чаще всего готовят круглой формы с диамет­ром в 4-5 мм и располагают друг от друга и от центральной лунки на расстоянии 5-6 мм. Для удобства работы и стандартизации располо­жения лунок можно приготовить трафаретку, которую помещают под дно чашки в процессе приготовления лунок. Лунки удобнее всего го­товить путем выдавливания агара металлической или стеклянной тон­костенной трубкой диаметром 4-5 мм с надетым на конец трубки рези­новым баллончиком (груша), с помощью которого отсасывают стол­бик выдавленного агара. Для создания дна у лунок в каждое приготов­ленное отверстие затем закапывают по одной капле расплавленного агара. В приготовленные таким образом лунки затем вносят антигены и сыворотки, каждый компонент соответственно в свою лунку по 3-4 капли (до заполнения лунки). После заполнения лунок чашку ставят в термостат при 37°С и, чтобы не было высыхания агара, в чашку кла­дут кусочек ваты, смоченной водой.

Учет реакции проводят через 24-48 и 72 часа. Для этого чашки вы­нимают из термостата и просматривают на темном фоне при нижнем боковом освещении с помощью осветителя к микроскопу. В положи­тельных случаях между лунками со специфическими компонентами появляется за счет образования преципитата серо-белая полоса пре­ципитации, хорошо видимая на темном фоне. Располагается полоса, как правило, перпендикулярно линии мысленно соединяющей лунки со специфическими компонентами. С целью усиления видимости полос иногда проводят обработку агара с прошедшей реакцией 0,065%-ным ра­створом серно-кислого кадмия.

С целью экономии агара и при исследовании небольших количеств материала реакцию можно ставить на предметных стеклах. Для этого расплавленный агаровый гель наносят на чистое предметное стекло с таким расчетом, чтобы слой агара после застывания был 3-4 мм. После застывания агара в нем так же, как и в чашках Петри, делают лунки и в них вносят антиген, и сыворотки. Стекло с агаром затем помещают в чашку Петри, сбоку кладут кусочек ваты, смоченной водой, и ставят в термостат при 37°С. В этом случае реакция проходит быстрее и поло­сы преципитации появляются уже через 18-24 часа.

Одновременно с постановкой реакции ставят контроли: стандарт­ной сыворотки со стандартным антигеном (реакция положительная), нормальной сыворотки со стандартным антигеном и нормальной сы­воротки с исследуемым антигеном (реакции отрицательные).

an

3. РЕАКЦИЯ ИММУНОЭЛЕКТРООСМОФАРЕЗА (РИЭОФ)

Сущность и механизм РИЭОФ заключается в том, что под действи­ем электрического поля антиген, помещенный в лунке в агаровом геле, перемещается к положительному полюсу, а антитело к отрицательно­му, т. е. навстречу друг другу, и по месту их встречи и соприкоснове­ния образуется хорошо видимая между лунками со специфическими компонентами серо-белая полоса (линия) преципитации. Следователь­но, здесь в отличие от РДП. миграция антигена и антител в агаровом геле происходит навстречу друг другу под действием электрического поля. Аг имеет отрицательный заряд, а Ат - положительный.

Применяется РИЭОФ в диагностике многих вирусных болезней, но особенно широко ее используют для диагностики плазмоцитоза но­рок (Алеутская болезнь норок).

Электрофоретическая подвижность белков зависит от величины за­ряда молекулы и рН раствора. При рН 8,6-8,9 антиген вируса алеутс­кой болезни (АБ) заряжен отрицательно и движется от катода к ано­ду, а белки сыворотки крови, и особенно гамма-глобулины (антите­ла), к катоду.

При диагностике плазмоцитоза норок в РИЭОФ исследуют в ос­новном сыворотки крови на содержание антител (преципитинов). Дли постановки этой реакции вьи ус&ается набор диагностикумов - анти­ген и сыворотки: иммунная и нормальная (для контролей). Для поста­новки РИЭОФ нужно иметь приборы ПЭФ-3, ЭФ-3 или аналогич­ных марок, вероналово-мединаловый или другие буферные растворы с рН 8,6-8,9, пригодные для электрофареза белков. Вероналово-меди­наловый буфер готовят так: растворяют 10,32 г мединала в 300 мл ди­стиллированной воды и затем добавляют 1,84 г веронала, выдержива­ют в водяной бане при 40°С до растворения, затем доводят дистилли­рованной водой до 1 литра. Если рН раствора получается ниже 8,6 добавляют мединал, а если выше - веронал и так доводят рН до нуж­ной концентрации. Этот же буфер используют и для приготовления 1%-ного агарового геля, но его дополнительно разводят наполовину (1:1) дистиллированной водой.

Реакцию ставят в зависимости от объема исследований или на пред­метных стеклах (при единичных исследованиях) или на стеклянных пластинах размером 8x15 см, или иного размера.

На чистую обезжиренную стеклянную пластину (предметное стек­ло) размером 8x15 см наливают 30 мл 1%-ного расплавленного агара (агар Дифко или специальный агар для электрофареза, приготовлен­ный на буферном растворе). После застывания в агаровом геле делают лунки при помощи пробойника соединенного трубкой с вакуумным насосом. Диаметр лунок 2,8 мм, глубина 2,5 мм и расстояние между центрами соседних лунок 6 мм. Получается объем лунки, вмещающий 0,01 мл антигена или - сыворотки крови. Лунки располагают горизон­тальными рядами, по краям агаровые пластины (на расстоянии не ме­нее 1 см) не должны иметь лунок. Для более точного размещения лу­нок в агаровой пластине можно, в качестве трафарета, вниз под стек­лянную пластину поместить заранее размеченную миллиметровую бумагу. В каждую из лунок вносят пастеровской пипеткой соответству­ющие компоненты реакции: в одни антиген, в другие сыворотки кро­ви. Пластины помещают в камеру для электрофареза; к краям пласти­ны прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, концы которых опускают в ванну с буферным раствором. Камеру закрывают крыш­кой и подключают к выпрямителю тока так, чтобы положительный полюс был со стороны лунок с сыворотками. Сила тока должна быть 10-15 миллиампер на платину, напряжение на выходе 120-220 в.

Учитывают реакцию просмотром пластин над осветителем ИО-19 через 45 минут после выдерживания в электрическом поле. Оконча­тельно читают реакцию после выдерживания стекол с агаровыми пла­стинами в гипертоническом растворе (12,5%) хлористого натрия и пос­ледующего отмывания дистиллированной водой для удаления неспе­цифических полос сывороточного белка.

4. РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РГА)

РГА не относится к серологическим реакциям, так как в ней не уча­ствует иммунная сыворотка, т. е. антитела. В основе РГА лежит агглю­тинация, т. е. склеивание эритроцитов человека, животных и птиц под действием вируса. Впервые РГА была описана в 1941 году Херстом, который показал, что эритроциты цыплят способны агглютинировать­ся под воздействием аллантоисной жидкости, содержащей вирус грип­па. Позже было установлено, что способность вызывать агглютинацию эритроцитов обладают не только вирусы гриппа, но и некоторые дру­гие представители миксовирусов (вирусы парагриппа, паротита, болез­ни Ньюкасла и др.), аденовирусы, вирусы оспы, некоторые нейротроп- ные вирусы и другие. РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрова-

ния вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемаг- глютинирующих единиц - АЕ). С помощью РГА нельзя иипировать и идентифицировать вирусы, т. к. в ней не участвует сыворотка (анти­тело). Гемагглютинацией обладают не все вирусы. Миксовирусы агг­лютинируют эритроциты многих видов животных, кур и человека. При постановке РГА нужно знать, какие эритроциты данным вирусом агг­лютинируются.

Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок. Ме­ханизм РГА заключается в следующем: на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбиро­вать до 10.000 вирионов, а на поверхности гемагглютинирующих ви­русов располагаются гемагглютинины - сложные белковые тела с эн- зиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вируссо­держащей жидкостью гемагглютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Ви- рионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободны­ми поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, ч го и приводит к склеиванию (агглютина­ции) эритроцитов.

Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзиматическим про­цессом. Через некоторое время после проявления гемагглютинации связь между вирусами и эритроцитами нарушается, так как вирусная муциназа разрушает рецепторы эритроцитов и вирусы элюируют (от­соединяются) с эритроцитов. Это надо иметь в виду при учете реак­ции. После элюции вируса эритроциты оседают на дно пробирки в виде бугорка (холмика, пуговки). Использованные в РГА эритроциты вто­рично этим же вирусом не агглютинируются, т. к. чувствительные к данному вирусу рецепторы у эритроцитов уже разрушены, но могут быть агглютинированы другими вирусами, к которым сохранились рецепторы.

В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, смывы, материал из зараженных кури­ных эмбрионов, культур ткани и др.), в котором предполагается нали­чие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.

Эритроциты применяют в виде 1% взвеси в физиологическом ра­створе. Они могут быть свежеприготовленные или консервированные.

Физиологический раствор для постановки реакции используют с рН 7,0 - 7,4.

Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обез­жиренное предметное стекло наносят одну каплю вируссодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой. В положительных случаях че­рез несколько минут произойдет агглютинация эритроцитов в виде об­разования хлопьев.

При постановке реакции пробирочным способом используют се­рологические пробирки или панели (пластины из стекла или оргстек­ла) с лунками. В этом случае предварительно готовят двукратные раз­ведения вируссодержащего материала, начиная с 1:10 (и далее дву­кратные разведения: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д.) и до 1:1280 (иногда и более высокие). К каждому из разведений вируссодержащего материала, взя­тых в объеме по 0,5 мл, затем добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эрит­роцитов и пробирки после встряхивания оставляют в покое на 30-60 ми­нут при комнатной температуре, а затем учитывают результаты. Оце­нивают реакцию в крестах (плюсах).

При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осад­ка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробир­ки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста (++++). При оседании эритроцитов в виде зонтика, но с наличием менее равномер­ного распределения его по дну - три креста (+++). Если эритроциты осели в виде зонтика, но с волнистыми краями и в центре дна имеется более толстый слой из осадка неагглютинированных эритроцитов, ре­акцию считают в два креста (++). Значительное оседание эритроци­тов плотным диском в центре пробиркой с зернистой каймой по кра­ям (при наклоне пробирки эритроциты сползают) оцениваются в один крест (+). Если же эритроциты оседают на дно пробирки в виде хол­мика (бугорка) с ровными краями, при наклоне пробирки сползают такую реакцию считают отрицательной (-).

Титром вируса считается то наибольшее разведение его, которое способно давать реакцию гемагглютинации не менее чем в два (++) креста. Такое разведение содержит одну гемагглютинирующую еди­ницу (1 АЕ).

5. РЕАКЦИЯ ЗАДЕРЖКИ (ТОРМОЖЕНИЯ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РЗГА, РТГА)

РЗГА широко применяется в практике как для выявления и оп­ределения титра антител в сыворотке крови больных и вакциниро­ванных животных, так и для идентификации выделенных вирусов по известной сыворотке. Ставить эту серологическую реакцию мож­но только с теми вирусами, которые обладают гемагглютинирую- щими свойствами.

Сущность РЗГА заключается в том, что, если к вирусу, обладающе­му гемагглютинирующими свойствами, добавить сыворотку, содержа­щую специфические вирусу антитела, и смесь выдержать в контакте 30-60 минут, а затем внести взвесь эритроцитов, гемагглютинация не наступит, т.е. произойдет задержка (торможение) гемагглютинации. Следовательно, здесь гемагглютинирующая способность вируса нейт­рализуется специфическими антителами.

При постановке реакции следует иметь в виду, что некоторые жид­кости организма (сыворотка крови, моча, слюна, молоко и др.) могут содержать ингибиторы, которые могут тормозить реакцию и задержи­вать гемагглютинацию. В этих случаях нормальная сыворотка, т. е. сы­воротка от здоровых животных, может дать задержку гемагглютинации, что приведет к ошибочным результатам. В сыворотках крови некото­рых здоровых людей и животных выявлено два типа ингибиторов - тер­мостабильные и термолабильные. Термолабильные ингибиторы обна­руживаются в бета-фракциях глобулина и они обладают свойствами бета-глобулина, подавляют гемагглютинацию, нейтрализуют вирус и являются важным фактором противовирусного иммунитета. Они ме­шают постановке РЗГА и от них избавляются инактивированием сы­воротки при 56-65°С в водяной бане 30 минут. Термостабильные ин­гибиторы (ингибиторы Френсиса) содержатся в альфа-фракции гло­булина, они устойчивы к высоким температурам (даже к кипячению) и действию щелочи, подавляют гемагглютинацию, но вируснейтрали- зующими свойствами не обладают. Удаляют термостабильные инги­биторы из сывороток крови обработкой сывороток углекислым газом, фильтратом культуры Вибриона холеры или перйодатом калия.

Для постановки РЗГА необходимо предварительно провести тит- рацию вируса в РГА, чтобы определить 1 АЕ. При постановке РЗГА вирус берут в титре 4 АЕ, т. е. разведение в 4 раза меньшее, чем был титр вируса в РГА. Например, титр вируса, содержащий 1 АЕ, равен 1:64, значит 4 АЕ будет содержаться в разведении вируса 1:16.

Все сыворотки перед постановкой РЗГА прогревают для удале­ния термолабильных ингибиторов в течение 30 минут при темпера­туре 56-65°С в зависимости от вида животных.

Для постановки реакции в одном ряду пробирок или лунок готовят разведения сыворотки на физиологическом растворе. Обычно в пер­вой пробирке готовят разведение 1:10, а далее из него двухкратные разве­дения до 1:1280 и иногда более высокие. Затем из этого ряда по 0,25 мл соответствующих разведений сыворотки переносят во второй ряд про­бирок и туда же добавляют по 0,25 мл вируса, содержащего 4 АЕ. Встря­хиванием пробирок жидкость перемешивают и смесь выдерживают 30-60 минут в контакте при комнатной температуре или в термостате. После этого во все пробирки вносят по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритро­цитов, пробирки встряхивают и вновь выдерживают смесь в контакте 30-60 минут. Параллельно ставят контроли:

а) контроль сыворотки на спонтанную агглютинацию: к 0,25 мл сы­воротки, в разведении 1:20 добавляют 0,25 мл физраствора и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов (сыворотка не должна давать агглютинации);

б) контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию; к 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов добавляют 0,5 мл физраствора. Агглюти­нации не должно быть;

в) контроль реакции с нормальной сывороткой и антигеном - агг­лютинация должна быть. / ^СЦ

В положительных случаях при учете РЗГА будет отсутствовать аг­глютинация эритроцитов, в то время как этот же вирус без добавления сыворотки и с нормальной сывороткой будет вызывать четкую гемаг­глютинацию. С помощью РЗГА можно определить нарастание титра антител в процессе динамики болезни. Титром антител считается наи­высшее разведение сыворотки, которое задерживает проявление гемаг­глютинации.

6. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РИГА, РПГА)

В последние годы при диагностике вирусных болезней все шире вне­дряется РНГА(РПГА), которая более чувствительная, чем прямая РГА и является специфической серологической реакцией.

Целый ряд вирусов способны адсорбироваться на эритроцитах и при этом не вызывать их агглютинацию. Если же к таким эритроци­там, сенсибилизированным антигеном, т. е. несущим на себе адсорби­рованный вирус, добавить иммунную специфическую сыворотку про­исходит агглютинация эритроцитов с помощью антител иммунной сы­воротки.

В настоящее время при некоторых вирусных болезнях разрабаты­ваются и выпускаются предприятиями биопромышленности такие эритроцитарные диагностикумы. Эритроциты для лучшей адсорбции на них вируса (или антител) предварительно обрабатывают раство­ром таннина путем смешивания равных объемов 2,5% взвеси эритро­цитов и раствора таннина (1:200.000), затем центрифугируют и отмы­вают фосфатным буфером. На обработанные таннином эритроциты затем адсорбируют вирус и получают эритроцитарный антиген, кото­рый затем и используют для исследования сывороток крови на нали­чие антител. С целью выявления вируса в исследуемом материале и для его идентификации и типизации применяют эритроцитарный ди- агностикум, сенсибилизированный специфическими антителами, т. е. несущий на себе адсорбированные антитела.

Для постановки реакции в пробирки вносят по 0,5 мл соответству­ющего разведения исследуемой сыворотки (при исследовании на наличие антител) и 0,1 мл взвеси сенсибилизированных вирусом эритроцитов (эритроцитарный антиген). В качестве контролей ста­вят параллельно реакцию с положительной и нормальной сыворотка­ми и этим же эритроцитарным антигеном. Пробирки после встряхи­вания ставят в термостат или оставляют при комнатной температуре на 40-60 минут и учитывают результат. Если исследуемая сыворотка иммунная, т. е. содержит антитела, происходит агглютинация jgpmpo- цитов (положительная реакция, животное инфицировано). Эта реак­ция более перспективна, чем прямая, для диагностики вирусов, и особен­но тех, которые сами не обладают гемагглютинирующими свойствами.

Для выявления вируса в патологическом материале используют эритроцитарный диагностикум с адсорбированными антителами. Если в патматериале содержится вирус специфичный для антител, насту­пает агглютинация эритроцитов.

7. РЕАКЦИЯ ГЕМАДСОРБЦИИ (РГАд)

И РЕАКЦИЯ ЗАДЕРЖКИ ГЕМАДСОРБЦИИ (РЗГАд)

РГАд ставится на культурах ткани при некоторых вирусных бо­лезнях с целью обнаружения вируса в клетках зараженных культур тка­ни на ранних стадиях размножения вируса, т. е. до появления цитопа- тогенного действия (ЦДД). По своей сущности эта реакция не являет­ся серологической и основана на способности зараженных вирусом кле­ток культуры ткани адсорбировать на себе эритроциты. Для постанов­ки РГАд используют зараженные вирусом культурны ткани в пробир­ках. В пробирки с культурой ткани, зараженной вирусом, не удаляя поддерживающей среды, вносят 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов. После этого пробирки оставляют в наклонном положении под углом в 7-10° на 10-15 минут и по истечении этого времени просматривают под микроскопом. При постановке реакции во втором варианте из проби­рок с зараженной культурой ткани предварительно сливают культу- ральную жидкость и затем вносят 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эритроци­тов, пробирки оставляют в наклонном положении на 10-15 минут, затем культуру ткани промывают физиологическим раствором (ос­торожно споласкивают и сливают) и смотрят под микроскопом. При положительной реакции эритроциты адсорбируются на зараженных клетках и хорошо видны в виде гроздьев, розеток или беспорядочных скоплений. Если клетки не инфицированы вирусом, то на них эритро­циты не адсорбируются и свободно плавают в культуральной жидко­сти^ первом варианте) или смываются при промывании физраствором и не видны (во втором варианте).

РЗГАд. В основе этой серологической реакции лежит способность специфической иммунной сыворотки нейтрализовать гемадсорбиру- ющие свойства клеток культуры ткани, зараженных вирусом. С помо­щью РЗГАд можно идентифицировать вирус по известной иммунной сыворотке или выявлять антитела в исследуемых сыворотках крови по известному антигену (вирусу). Вирус африканской чумы свиней по РЗГАд имеет 7 серотипов. Для постановки реакции из зараженных пробирок с культурой ткани сливают поддерживающую среду и куль­туру ткани промывают споласкиванием раствором Хенкса, затем в пробирки вносят но 0,2 мл специфической иммунной сыворотки и 0,8 мл раствора Хенкса (в контрольные пробирки вносят только раствор Хен­кса без добавления сыворотки). Сыворотку с зараженной культурой ткани контактируют в термостате или при комнатной температуре 40-60 минут и затем в пробирки вносят по 0,2 мл 0,5%-ной взвеси эрит­роцитов, оставляют на 10-15 минут и просматривают под микроско­пом. Контролем является реакция с нормальной сывороткой. Если сы­воротка была идентична вирусу, то специфические антитела предотв­ращают адсорбцию эритроцитов на клетках и реакция считается по­ложительной. В контрольных пробирках с нормальной сывороткой и в пробирках, не содержащих сыворотки, должна быть гемадсорбция. 8. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Из серологических реакций, применяемых для диагностики вирус­ных болезней, РСК является наиболее трудоемкой и сложной. Ставят РСК для диагностики многих вирусных болезней, но особенно широ­ко для диагностики и типизации вируса ящура. РСК является высоко чувствительной серологической реакцией, позволяющей определять в исследуемом материале как антиген, так и антитела и устанавливать их количество. J

Для постановки реакции необходимы пять компонентов, из которых только один является неизвестным (антиген или антитело 4шксистемы), а остальные четыре компонента должны быть заранее известными.

Антигеном в РСК служит вируссодержащий материал. Если про­водят исследования сывороток крови от больных или переболевших животных на наличие комплементсвязывающих антител, то антиген берут заранее известный (стандартный). Готовят такие антигены на биофабриках и выпускают с определенным титром.

Чаще антиген в РСК является неизвестным компонентом и его го­товят в лабораториях сами из присланного для исследований матери­ала. В этом случае для определения антигена применяют стандартные биофабричные иммунные сыворотки (при ящуре типоспецифические). Вируссодержащий материал для приготовления антигена берут с со­блюдением стерильности из тех органов и тканей, в которых происхо­дит наибольшее накопление вируса (при бешенстве и энцефаломие­лите - мозговая ткань, при ящуре - афты и их содержимое, при вирус­ным, гепатите - печень и т. д.).

Из вируссодержащего материала готовят суспензию измельчением и растиранием в ступке со стерильным битым стеклом или кварцевым песком и к растертой массе добавляют двойное количество по отноше­нию к массе взятого патматериала фосфатного буфера или физиологи­ческого раствора с рН 7,2-7,4. Суспензию переносят в центрифужные пробирки и подвергают 2-3 - кратному замораживанию при -20-50° С с последующими оттаиваниями в термостате или при комнатной тем­пературе, а затем центрифугируют при 3000 оборотов в минуту и по­лучают прозрачную надосадочную жидкость, которую и используют в качестве антигена. Такой антиген можно консервировать мертиолатом 1:10.000. Хранят антиген в холодильнике при +4°С.

В качестве антигена может служить также жидкость из заражен­ных вирусом куриных эмбрионов и культур тканей.

Сыворотки. Для диагностических целей используют стандартные нормальные и иммунные сыворотки, которые готовят на биофабри­ках путем гипериммунизации животных и выпускают расфасованны­ми в ампулах с определенным титром антител. Для диагностики ящу­ра на биофабриках готовят типоспецифические сыворотки путем гипериммунизации кроликов каждым типом вируса ящура в отдель­ности. Поэтому сыворотка для бактериолитической системы РСК чаще является заранее известным компонентом и по ней определяют изуча­емый антиген по специфичности их взаимодействия. Сыворотки крови от больных или переболевших животных для исследования на наличие антител присылают из хозяйств.

Все сыворотки для РСК стандартные и исследуемые предваритель­но инактивируют прогреванием в водяной бане при 56-65° С в зависи­мости от вида животных.

Комплемент. Комплемент - это неспецифический термолабильный белок, фактор литического действия (по французски - дополнение), содержащийся в нормальной сыворотке крови любого животного и че­ловека. Особенно много комплемента содержится в сыворотке крови морских свинок. Поэтому в качестве комплемента в РСК обычно ис­пользуют сыворотку крови морских свинок. Получать комплемент можно в лаборатории. Для этого берут кровь у морских свинок из сер­дца стерильным шприцем, ставят на 1-2 часа в термостат или теплое место для свертывания, затем обводят стеклянной палочкой и центри­фугируют для отделения сыворотки или отстаивают 18-20 часов в хо­лодильнике, сыворотку пипеткой отсасывают и сохраняют в холодиль­нике при +4°С. Биофабриками выпускают лиофильно высушенный (сухой) комплемент в ампулах, который, может сохраняться до года. Перед Использованием сухого комплемента его предварительно ра­створяют до нативного состояния, т. е. доводят до объема, указанного на ампуле добавлением физраствора, а затем из него готовят разведе­ния для титрования и на главный опыт РСК.

Комплемент не обладает специфичностью и в зависимости от ре­зультатов реакции может участвовать или в баксистеме (при положи­тельной реакции) или в гемсистеме (при отрицательной реакции). Он очень нестоек и быстро разрушается при хранении, воздействии света, при встряхивании и нагревании. Температура 56-58°С разрушает ком­племент за 30 минут. Сыворотка крови, лишенная комплемента, назы­вается инактивированной. Инактивацию сывороток проводят прогре­ванием их в водяной бане. Комплемент в РСК берут в строго определен­ных количествах, чтобы его хватило только на одну систему, а поэтому его предварительно титруют. При избытке комплемента он может уча­ствовать в бактериолитической и гемолитичёской системах, что приве­дет к ошибке в постановке диагноза.

Комплемент обладает свойством лизировать антиген, но только в присутствии и при помощи специфического антитела.

В реакцию комплемент может вступать только при наличии комп­лекса «антиген + антитело», а в отдельности с каждым из них компле­мент не соединяется. Поэтому, если в бактериолитической системе не будет такого комплекса «антиген + антитело», комплемент остается свободным несвязанным и переходит в гемолитическую систему, где и вызывает гемолиз, т. к. гемсистема является индикаторной системой и в ней всегда есть комплекс «антиген + антитело» в виде гемолизина (антитело) и эритроцитов барана (антиген для гемолизина).

Перед постановкой главного опыта РСК (в день постановки) комп­лемент обязательно титруют в гемолитической системе. Для этого бе­рут ряд пробирок и комплемент, разведенный 1:20, разливают в дозах: в первую пробирку 0,05 мл, во вторую - 0,10 мл, в третью - 0,15 и так далее с интервалом 0,05 мл до 0,40 мл. В каждую пробирку затем недо­стающее количество до объема 0,5 мл доливают физраствором. Это будет соответствовать 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 и 4% цельного комп­лемента, содержащего в дозе 0,5 мл разведения с физраствором. Затем в пробирки вносят по^5_мл.гемолизина в рабочем титре и 2%-ной взвеси эритроцитов (лучше заранее приготовить гемолитическую систе­му, т. е. смешать гемолизин в рабочем титре с равным объемом 2%-ной взвеси эритроцитов, и вносить гемолитическую систему по 1,0 мл) и по 1 мл физраствора (см. схему).

Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню при 37-38°С на 15 минут, после чего проводят учет реакции. Титром комплемента счи­тается то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемо­лиз эритроцитов. При определении типов вируса ящура используют комплемент, который при указанных условиях имеет титр не ниже 2,5%.

В дальнейшем для постановки главного опыта (например, при ящу­ре) комплемент берут с постоянным излишком в 1%, или две условные единицы от титра его в гемолитической системе. Например, если титр комплемента в гемсистеме будет 1,5%, то за рабочее разведение его сле­дует взять 2,5%, что составляет 2 единицы.

Схема титрования комплемента

Компоненты	Содержание цельного комплемента в %
	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5	3,0	3,5	4,0
Комплемент в разведении 1:20	0,05	0,10	0,15	0,20	0,25	0,30	0,35	0,40
Физраствор (до 0,5 мл.)	0,45	0,40	0,35	0,30	0,25	0,20	0,15	0,10
Гемолизин в рабочем титре	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Эритроциты (2% взвесь)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Физраствор (вместо антигена и сыворотки)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

Гемолизин. Это специфическое антитело на эритроциты барана. Получают гемолизины на биофабриках путем гипериммунизации кро­ликов эритроцитами барана и в результате у кроликов на эти эритро­циты (как антиген), образуются антитела - гемолизины. Кролика затем обескровливают и получают сыворотку. Сыворотка крови кро­лика, содержащая гемолизины, называется «гемолитическая сыворотка». Такую сыворотку инактивируют прогреванием в бане для разрушения комплемента, консервируют (иногда глицерином 1:1) и расфасовыва­ют по ампулам. Выпускают гемолизин биофабрики в жидком или су­хом виде (при консервировании глицерином 1:1 следует учитывать при приготовлении разведений гемолизина).

Гемолизин обладает свойством лизировать эритроциты барана, но только в присутствии комплемента и при его помощи.

Гемолизин в лаборатории обязательно титруют при получении све­жей серии и затем один раз в два-три месяца. Для титрования его раз­водят физраствором. Первое разведение готовят 1:100, для этого из ам­пулы (если консервирован глицерином 1:1, с учетом глицерина берут 0,2 мл и добавляют 9,8 мл физраствор) берут 0,1 мл и добавляют 9,9 мл физраствора. Из разведения 1:100 далее готовят основное разведение 1:1000 (берут 1 мл разведения 1:100 и добавляют 9 мл физраствора), из которого затем готовят дальнейшие разведения: 1:1500; 1; 2000; 1:3000; 1:4000; 1:5000; 1:6000 (см. схему).

Схема приготовления разведений гемолизина

Необходимое разведение	1:1500	1:2000	1:3000	1:4000	1:5000	1:6000
Гемолизин 1:1000 в мл	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Физраствор в мл	0,5	1,0	2,0	3,0	4,0	5,0

Затем в пробирки второго ряда берут по 0,5 мл соответствующих разведений гемолизина, добавляют по 0,5 мл 2%-ной взвеси эритроци­тов, по 0,5 мл комплемента в разведении 1:20 и по 1,0 мл физиологи­ческого раствора (вместо антигена и сыворотки). Пробирки выдержи­вают в бане при 37-38°С 10 минут после чего проводят учет реакции.

Титром гемолизина считают то наивысшее разведение его, которое вызывают полный гемолиз эритроцитов. Этот титр называется пре­дельным или номинальным. В главный опыт РСК гемолизин берут в рабочем титре. За рабочий титр гемолина считают четырехкратную концентрацию от его предельного (номинального) титра. Если предель­ный титр гемолизина равен 1:3000, то рабочий титр будет 1:750. Для дальнейшей работы гемолизин в рабочем титре (разведении) смеши­вают с равным количеством 2%-ной взвеси эритроцитов и получают гемолитическую систему.

Эритроциты барана. Они являются антигеном в гемолитической системе (для гемолизина). Получают эритроциты в лаборатории от ба­рана или овцы. Для этого берут у барана кровь из яремной вены во флакон со стеклянными или фарфоровыми бусами и тщательно дефиб- ринируют встряхиванием, затем для освобождения от сгустков фибри­на фильтруют через марлю в центрифужные пробирки и центрифуги­руют 10-15 минут при 2-3 тысячах оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку эритроцитов добавляют физраствор, пе­ремешивают и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость опять удаляют, вносят новую порцию физраствора и так отмывают эритроци­ты физраствором до тех пор пока надосадочная жидкость будет оста­ваться бесцветной (3-5 раз). После отмывания надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, а из осадка эритроцитов готовят 2%-ную взвесь, которую и используют для постановки РСК и для титраций.

Для длительного хранения эритроцитов в последнее время широко используется раствор Альсевера (на 100 мл дистиллированной воды берут декстрозы 20,5 г, цитрата натрия 8,0 г, лимонной кислоты 0,55 г, хлористого натрия 4,2 г), который стерилизуют 10 мин при 0,6 атм. в авуоклаве и добавляют на 2 части крови 1 часть раствора Альсевера. I у>ДЛ Вышеуказанные пять компонентов составляют в РСК две системы: ₍ ^б^т^и^лщт^щю (антиген + иммунная сыворотка, т. е. антитело и комплемент) и гемолитическую (гемолизин и эритроциты барана).

Комплемент в положительных случаях участвует в бактериолити­ческой системе (баксистеме), в отрицательных - в гемолитической (гемсистеме). Гемолитическая система выполняет роль индикатора и по ней судят о том, как прошла реакция в баксистеме, баксистема - это диагностическая система.

Сущность РСК. Если в исследуемом патологическом материале имеется вирус (антиген), он соединяется с антителами иммунной сы­воротки и образуется комплекс «антиген + антитело», который связы­вает комплемент в баксистеме и свободного комплемента для гемсис- темы не остается. Поэтому при последующем добавлении в пробирки гемсистемы, несмотря на то, что там всегда есть комплекс «антиген (эритроциты барана) + антитело (гемолизин)», гемолиз эритроцитов не происходит потому, что для гемсистемы не осталось комплемента. Такая реакция считается положительной. Если исследуют сыворотки крови от больных или переболевших животных на наличие антител, то берут заранее известный стандартный антиген. Если в баксистеме не образовалось комплекса (не было в патматериале вируса, или не было в сыворотке крови антител), комплемент переходит в гемсистему и, соединяясь в ней с комплексом «гемолизин + эритроциты барана», вызывает гемолиз эритроцитов. Такая реакция считается отрицательной. Для постановки РСК необходимо выполнять следующие условия:

1. Ставить реакцию в строгой последовательности: вначале в бак­системе при 37-38 °С в течение 20 минут, или при температуре 3-4°С (в холодильнике) в течение 16-18 часов (РДСК), а затем в гемсистеме при 37-38°С в течение 30 минут;

2. Сыворотки инактивированные;

3. Каждый компонент вносят в количестве по 0,2 мл (или в минива- рианте по 0,025 мл) и в рабочих титрах, а поэтому перед постановкой РСК их титруют;

4. Общий объем жидкости в пробирке должен быть равен 1,0 мл (для микроварианта 0,125 мл). Если какой-либо компонент в реакцию не вносят (например, в контролях, при титрации), то вместо него вно­сят такое же количество физраствора;

5. Физиологический раствор применяют чистый, сдежий, проки^ пяченный и без консервантов; s ' t ^ ' С & \

Главный опыт РСК. При постановке главного оп^та вначале вно­сят компоненты факсисгешя и ставят реакцию в бдксистедое в водяной бане при 37-38°С 20 минут (РСК) или при +4°С в холодильнике в те­чение 16-18 часов (РДСК), а затем добавляют компоненты гемсисте­мы и ставят реакцию в гемсистеме при температуре 37-38°С 30 минут, после чего учитывают (читают) реакцию.

Наиболее часто РСК ставят для идентификации и типизации вы­деленных типов вируса ящура. При определении типов вируса ящура перед проведением главного опыта позитивные диагностические сыво­ротки и антиген не титруют, а используют их в удвоенном (т. е. двух­кратном) титре. Например, если титр сыворотки, указанный на этикет­ке, 1:40, то берут 1:20. Также поступают и со стандартными антигенами.

Все компоненты реакции разливают по 0,2 мл (в микроварианте по 0,025 мл). Испытуемый антиген в реакции исследуют цельный, т. е. приготовленная из афт суспензия на физиологическом растворе 1:2 (33%-ная взвесь), а также в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Реакцию ставят с различными типоспецифическими диагностическими ящурными сы­воротками параллельно, комплемент берут 2 единицы.

Цельный антиген и каждое его разведение вносят в пробирки по 0,2 мл, туда же затем добавляют по 0,2 мл стандартной диагностической сы­воротки в удвоенном титре и по 0,2 мл комплемента, содержащего 2 рабочие дозы (единицы). После встряхивания пробирки ставят на 20 минут в водяную баню при температуре 37-38°С. Затем в пробир­ки вносят по 0,4 мл гемолитической системы и снова ставят в водяную баню на 30 минут, после чего читают реакцию.