1) Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Используют этот метод заражения при выделении и культивировании нейротропных,

дерматропных н некоторых пантропных вирусов (оспа, энцефаломиелит, ИЛТ, ящур, бешенство, чума и др.). Эмбрионы применяются 7-12 - днев­ного возраста. Существует 3 варианта заражения:

а) вскрывают пугу и срезают ее ножницами, отделяют подскорлуп- ную оболочку и наносят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) ма­териал. Отверстие в яйце затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края колпачка парафинируют;

б) выпиливают надфилем (напильничек) или зазубренным скаль­пелем в скорлупе треугольник с длиной сторон около 1 см на границе пуги со стороны предлежания эмбриона, пинцетом удаляют участок скорлупы и подскорлупной оболочки и вводят материал. Отверстие закрывают покровным стерильным стеклом и края парафинируют, или заклеивают стерильным лейкопластырем. Лейкопластырь для этих целей предварительно нарезают на кусочки нужной величины и поме­щают в 70°-ный спирт, где хранят, а когда нужно берут пинцетом и после обжигания, на пламени используют в работе;

в) скальпелем удаляют небольшой участок скорлупы площадью око­ло 0,5 см по месту предлежания эмбриона, затем пинцетом или иглой удаляют в этом участке подскорлупную оболочку и вводят материал. Если материал плохо входит в полость яйца, можно с помощью рези­новой груши через отверстие з скорлупе на пуге откачать воздух из пуги и в результате по месту введения материала образуется искусст­венная пуга и тогда материал легко вводится. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

Доза вводимого материала при заражении на хорионаллантоисную оболочку 0,1-0,2 мл.

2. Заражение в аллантоисную полость. Этот метод заражения очень прост и применяется для выделения многих вирусов. Для заражения берут 10-11 - дневные эмбрионы. Имеется два варианта заражения:

а) заражение проводят через пугу, не срезая ее. Иглой отмеряют расстояние от верхушки пуги до границы пуги, отмеченной каранда­шом на скорлупе, и вводят иглу на отмеченную глубину и углубляют еще на 0,5 см, чтобы проколоть хорионаллантоисную оболочку;

б) вводят материал иглой через прокол в скорлупе в месте предле­жания эмбриона на глубину 3-5 мм в бессосудистом участке. Доза за­ражения 0,1-0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают лейкопластырем или парафинируют.

2. Заражение в желточный мешок. Для заражения используют

   5. 8 - дневные эмбрионы. Доза вводимого материала обычно состав­ляет 0,2-0,3 мл. Существует два варианта заражения:

а) яйцо переворачивают местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят со стороны пуги в желточный мешок на глубину до эмбриона, но выше его расположения;

б) яйцо кладут на подставку также местом предлежания эмбриона вниз и иглу вводят сверху вниз по направлению к эмбриону на^гдуби- ну около^дгм. Место введения заклеивают лейкопластырем или пара­финируют.

2. Заражение в амниотическую полость. При этом методе зараже­ния вирус может проникнуть в различные клетки, находящиеся в кон­такте с амниотической жидкостью, и размножаться в них. Применяют

6. 11 - дневные эмбрионы, для удобства заражения рекомендуется за 2-3 дня до проведения заражения эмбрионы инкубировать пугой вверх. Тогда эмбрион и амнион смещаются вверх и удобнее заражать.

Имеется два варианта заражения:

а) вскрывают и срезают пугу, пинцетом удаляют подскорлупную оболочку и захватывают амнион. Подтягивают амнион пинцетом и вво­дят в амниотическую полость материал в дозе 0,1 мл. Отверстие в скор­лупе затем закрывают стерильным стеклянным колпачком и края па­рафинируют;

б) заражение с помощью длинной иглы через пугу в темной комна­те под контролем глаза. У иглы предварительно острие загибают под прямым углом, чтобы получилась маленькая площадка. Иглу вводят под контролем глаза через пугу до эмбриона, под давлением затуплен­ной иглы эмбрион в этом случае будет смещаться, затем легким толч­ком прокалывают амнион и иглу слегка оттягивают назад. При этом эмбрион должен смещаться за иглой вверх. Затем вводят материал.

5. Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Ис­пользуются 7-12 - дневные эмбрионы, заражение проводят введением материала в различные участки тела пли непосредственно в головной мозг. Для заражения вскрывают пугу и подтягивают пинцетом эмбри­он. При этих методах заражения может быть гибель эмбрионов от трав­мы до 30% и более от числа зараженных.

6. Заражение в крупные кровеносные сосуды хорионаллантоис- ной оболочки. Этот метод заражения, как и предыдущий, применяется очень редко. Материал вводят тонкой иглой после удаления скорлупы по ходу кровеносного сосуда непосредственно в сосуд по току крови.

После заражения куриные эмбрионы обязательно метят простым карандашом и ставят в термостат. За ними ежедневно наблюдают пу­тем просмотра, наблюдение ведут до 7-8 дней в зависимости от вида вируса. В случае гибели эмбрионов их срочно удаляют из термостата и ставят в холодильник до момента вскрытия. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов, это может быть от травмы или токсично­сти патматериала. Поэтому, так же как и при заражении лаборатор­ных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать не­сколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

Вскрытие погибших зараженных куриных эмбрионов, или изъятых по истечении срока наблюдения, производится со всеми правилами асептики в стерильных условиях бокса. При вскрытии скорлупу обра­батывают спиртом и обжигают, затем срезают пугу. У вскрытого эмб­риона сначала тщательно отсасывают аллантоисную жидкость (коли­чество ее около 7 мл), затем пинцетом оттягивают амниотическую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой и отсасывают амни­отическую жидкость (количество ее 1,0-1,5 мл), затем собирают жел­ток, извлекают оболочки и сам эмбрион. Жидкость, оболочки и сам эмбрион тщательно осматривают на наличие изменений. Амниотичес- кая жидкость в норме совершенно прозрачная, при заражении она мо­жет быть мутная, кровянистая. Характерные изменения, вызванные вирусом, бывают наиболее выраженными на хорионаллантоисной обо­лочке: появляются воспалительные очаги, непрозрачные, круглой формы и кровоизлияния. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.

Куриные эмбрионы в вирусологии широко применяются не только для выделения вирусов, но и для накопления и получения антигенов, для приготовления живых и убитых вакцин, титрования вирусов, для постановки реакции нейтрализации вирусов, Для аттенуирования (ос­лабления) вирусов, для изучения интерференции вирусов и получе­ния интерферона.

3. ВЫДЕЛ ЕН И Е В И РУСОВ НА КУЛ ЬТУ PAX ТКАН ЕЙ

Успешное развитие современной вирусологии обусловлено в зна­чительной мере применением различных культур тканей. Применение культур тканей в вирусологической практике дало возможность вести диагностические исследования без использования дорогостоящих ла­бораторных животных. Применяемые в практике культуры тканей об­ладают различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, а поэтому важно подобрать наиболее чувствительную ткань.

Культурой ткани называют кусочки ткани млекопитающих и воз­никающие из них участки клеточного роста, находящиеся в специаль­ной питательной среде вне организма. Культурой клеток принято называть систему более или менее однородных клеток, полученных из ткани какого-либо органа и выращенных на стенке пробирки, фла­кона или матраца (ин витро, т. е. вне организма). Практически культу­ру тканей и культуру, клеток обычно называют просто «культура тканей». Культуру ткани можно получать практически из любого органа живот­ных, человека или птиц, лучше для получения культур ткани брать ткань молодого организма и даже эмбриональную, т. к. клетки таких организмов более способны к размножению.

Теоретическое обоснование метода тканевых культур дали А. Е. Голубев в 1874 г. и И. П. Скворцов в 1885 г. Основоположни­ком получения тканевых культур и практического их применения является американский эмбриолог Росс Гранвиль Гаррисон(1907 г.). Левадити (1913 г.) выращивал в культуре ткани из ганглиев обезьяны вирус полиомиелита и бешенства, положив, таким образом, начало ме­тоду культивирования вирусов в выращиваемых ин витро тканях. В настоящее время накоплен большой опыт по выделению вирусов в культурах тканей и по технологии приготовления различных видов культур тканей.

Все существующие и применяемые в вирусологической практике в настоящее время культуры тканей можно разделить на следующие виды:

1. Переживающие культуры тканей;

2. Растущие культуры тканей:

а) плазменные;

б) однослойные: первично-трипсинизированные, субкультуры, дип­лоидные и перевиваемые.

Переживающие культуры тканей - это такие культуры тканей, у которых отсутствует пролиферация, т. е. рост и размножение кле­ток, но жизнеспособность клеток при этом сохраняется. Методика по­лучения переживающих культур тканей впервые была разработана и предложена Мейтландами в 1928 году, которые использовали почки кур. Приготовление переживающих культур тканей в общих чертах заключается в измельчении тканей какого-либо органа на кусочки око­ло 1 мм. Измельченные кусочки отмывают от форменных элементов крови и помещают в специальную питательную среду в стерильную посуду и инкубируют при 37°С. Фактически эти кусочки находятся во взвешенном состоянии в питательной среде, что достигается лег­ким перемешиванием среды. Переживающие культуры тканей приме­няются для приготовления некоторых вакцин в промышленных усло­виях. Так, например, готовят противоящурную вакцину по методу Френкеля на переживающей культуре ткани из эпителия языка КРС. Для других целей эти культуры тканей практически мало пригодны и не применяются. Наиболее широко используют культуры растущих клеток, т. к. в таких культурах хорошо видны при просмотре под мик­роскопом клетки и цитопатогенное действие вируса на клетки культу­ры и можно видеть взаимодействие вируса с клеткой на уровне клетки.

Культуры растущих клеток. Это такие культуры тканей, в кото­рых клетки пролиферируют, т. е. делятся и размножаются. После за­ражения таких культур .вирусом в них хорошо видно действие вируса на клетки в виде специфической дегенерации пораженных клеток. К культурам растущих клеток относят плазменные культуры и однослой­ные культуры тканей.

Плазменные культуры тканей (культуры фиксированных ку­сочков ткани). В основе приготовления плазменных культур поло­жен метод Карреля-Барроуса (1910 г.). Метод по своей технике очень прост и заключается в тщательном измельчении какого-либо органа на кусочки величиной до 1 мм с последующим отмыванием измельченной ткани солевым сбалансированным раствором от форменных элемен­тов крови. Затем в стерильную посуду (пробирки, флаконы, матрацы и др.) вносят несколько мл куриной плазмы крови и распределяют равно­мерным слоем по стенке или дну. В плазму на определенном расстоянии друг от друга помещают измельченные и отмытые кусочки ткани. Для свертывания плазмы вносят куриный эмбриональный экстракт. После свертывания плазмы кусочки прочно фиксируются на стенке посуды. В пробирки с фиксированными кусочками ткани вносят соответствующую питательную среду, закрывают резиновыми пробками и пробирки, или другую посуду, ставят в термостат для роста клеток при температуре 37°С. От кусочков начинают расти в сторону клетки, что видно под микроско­пом при малом увеличении (вид паучков). Питательную среду заменяют в зависимости от скорости роста клеток. При заражении такой культуры вирусом можно будет видеть действие вируса на клетки.

Фиксировать кусочки ткани можно помимо плазмы предваритель­ным нагреванием стенки пробирки до 45°С и кусочки ткани прикрепля­ются к предварительно нагретой стенке, а затем вносят питательную среду и ставят в термостат.

Однослойные (монослойные) культуры тканей. Это такие культуры, в которых клетки пролиферируют, т. е. растут и размножа­ются и образуют в результате этого на стенках пробирки или матраца сплошной клеточный пласт в один слой клеток. Методика получения однослойных клеточных культур тканей впервые была разработана в 1952 г. Дулбекко и в 1954 г. Дулбекко и Фогтом, которые использова­ли для этих целей ткани куриного эмбриона и почки обезьяны. В ос­нове метода лежит обработка измельченных и отмытых от формен­ных элементов крови кусочков тканей протеолитическими фермен­тами (трипсин, панкреатин, коллагеназа и др.) с целью получения взвеси отдельных клеток. Разъединение клеток происходит за счет разрушения ферментами межклеточных протоплазматических мости­ков. Наиболее широкое применение в вирусологической практике в настоящее время получила методика однослойных культур трипсини- зированных клеток, т. е. методика с применением трипсина.

Для приготовления однослойных культур можно применять раз­личные органы и ткани животных, птиц и человека. Однослойные куль­туры являются основными в вирусологии и представляют наиболее удобную биологическую модель для выделения вирусов, изучения про­цессов взаимодействия вирусов и клеток, они широко применяются в практической и научно-исследовательской работе для титрации виру­сов, для накопления вирусов и получения антигенов, вакцин, для поста­новки реакций нейтрализации вируса и задержки гемадсорбции т. д.

Для получения культур ткани очень важно правильно подобрать и подготовить посуду, пробки, питательные (ростовые) и поддержива­ющие среды, солевые растворы.

Посуду желательно применять из нейтрального стекла, она должна быть идеально чистая и хорошо вымыта. Существует много способов мытья, но все они сводятся к получению идеально чистой посуды с нейтральной рН. Чаще для этих целей применяют мытье с детским мылом и гексаметафосфатом. Хранить посуду для приготовления куль­тур тканей нужно отдельно от другой посуды и применять ее только для работы с культурами тканей. Пробки применяют резиновые, ко­торые также должны быть хорошо вымыты и стерильные. Инструмен­ты, применяемые для приготовления культур тканей, после стерилиза­ции кипячением хранят в спирте (ножницы, пинцеты, скальпели и др.).

Все солевые буферные растворы, а также питательные и поддер- >юивающие среды готовят только на би- и тридистиллированной воде.

Для отмывания тканей от кровяных элементов, приготовления раз­ведения трипсина используют фосфатные буферные растворы различ­ного состава и раствор Хенкса, включающий в состав 8 солей и глюкозу.

В качестве питательной среды для клеток чаще применяют раствор следующего состава: 80 частей рабочего раствора Хенкса +10 частей 5%-ного раствора гидролизата лактальбумина +10 частей сыворотки крови КРС. Используются и более сложные питательные среды - сре­да 199, среда Игла, среда Эрла и др. В среду Игла входит более 60 ком­понентов. Для контроля за изменением рН питательной и поддержи­вающих сред в процессе роста клеток в них вносят индикатор феноло­вый красный (фенолрот).

Вся работа по приготовлению культур тканей и в процессе зараже­ния ее вирусом проводится только в стерильных условиях бокса.

Однослойные культуры тканей делятся на следующие виды:

1. Первично-трипсинизированные культуры. Методику приготов­ления первично-трипсинизированных культур разработали Дулбек­ко и Фогт. Принцип приготовления таких культур ткани по методу Дулбекко и Фогт в модификации Янгнера заключается в следующем: стерильно извлекают почки обезьяны (можно также готовить культу­ру из любых органов животных, птиц и человека) и снимают капсулу, срезают корковый слой и измельчают его ножницами в баночке на мелкие кусочки. Измельченную ткань отмывают фосфатно-буферным раствором от форменных элементов крови до полного просветления надосадочной жидкости, затем на одну часть измельченной ткани вно­сят 3 части 0,25%-ного раствора трипсина, подогретого до 37°С, и ин­кубируют в термостате 30-40 минут, после чего трипсин сливают. К ткани затем добавляют новую порцию подогретого трипсина, перено­сят в колбочку с магнитиком и ставят колбочку на магнитную мешал­ку для лучшего разделения клеток (диспергирования). Полученную таким образом взвесь клеток в растворе трипсина сливают через мар­левый стерильный фильтр для освобождения от неразбившихся круп­ных частиц ткани во флакон и центрифугируют для осаждения клеток 5-10 минут при 1000-1500 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде для кле­ток. Полученную взвесь клеток подсчитывают с. помощью камеры Го- ряева из расчета на один мл, доводят концентрацию клеток до нужной посевной дозы (в зависимости от вида ткани и возраста животного от 200 тысяч до 800 тысяч клеток в 1 мл) добавлением питательной сре­ды и разливают по стерильным пробиркам или матрацам, которые за­тем ставят в термостат при температуре 37-38°С. Пробирки ставят в штативе наклонно под углом в 7-10°. В течение первых часов инкуба­ции в термостате клетки оседают и прикрепляются к стенке пробирки или матраца, а позже начинают расти и размножаться, образуя через некоторое время (1-5 дней) на стенке сплошной клеточный монослой. Клетки хорошо видны под малым увеличением микроскопа, а после заражения их вирусом можно видеть изменения в клетках за счет па­тогенного действия вируса.

По данным Янгнера и Л.Т. Степановой только 10% внесенных кле­ток прикрепляется, дают рост и принимают участие в образовании мо­нослоя. После сформирования монослоя культуру ткани используют для заражения вируссодержащим материалом.

Наиболее широко из первично-трипсинизированных культур тка­ней применяют культуру куриных фибробластов. Для получения культуры куриных фибробластов берут куриный эмбрион в возрасте 10-12 дней, дважды обрабатывают скорлупу спиртом и обжигают. За­тем в стерильных условиях извлекают со строжайшим соблюдением асептики эмбрион в стерильную чашку Петри, где с помощью пинце­тов удаляют глаза и кишечник. Кожно-мышечную ткань переносят в стерильную баночку и здесь ножницами измельчают нр. мелкие кусоч­ки до кашицеобразной массы, промывают 3-5 раз раствором Хенкса или другим фосфатно-буферным раствором для отмывания ткани от крови. Затем к отмытой ткани наливают 0,25%-ный раствор лодогре- того до 37°С трипсина из расчета на 1 г ткани 10-40 мл трипсина и ставят на 20-30 мин в термостат. После этого трипсин сливают, вносят фосфатно-буферный раствор, переливают в колбочку с магнитиком и ставят на магнитную мешалку. Перемешивают содержимое колбы на мешалке до тех пор пока кусочки ткани разобьются на отдельные клет­ки и жидкость станет мутной. Взвесь клеток затем через марлевый фильтр сливают во флакон. Если кусочки не разбились полностью и еще остались, наливают новую порцию буфера и опять диспергируют на магнитной мешалке, иногда так повторяют 3-4 раза. Взвесь клеток во фла­коне центрифугируют при 1,0-1,5 тысячах оборотов в минуту 5-10 минут и клетки оседают. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку нали­вают 5-10 или более миллилитров питательной среды и при помощи пипетки клетки ресуспензируют в питательной среде. Количество кле­ток в мл взвеси подсчитывают в камере Горяева, доводят до концент­рации 250-400 тысяч клеток в 1 мл и разливают по пробиркам. Пробир­ки закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат на подставку наклонно под углом 7-10°. Через 2-3 дня на нижней стенке пробирки вырастает клеточный монослой.

2. Субкультура (вторичная культура клеток). Получается из пер- вично-трипсинизированной культуры тканей. Для этого выросший клеточный монослой снимают со стенки пробирки или матраца путем соскабливания или воздействия раствором версена, затем подвергают трипсинизации для разделения клеток, центрифугируют, надосадоч­ную жидкость сливают, осадок клеточный ресуспензируют, разлива­ют и вновь выращивают в другой посуде и в новой порции питатель­ной среды. В этом случае вырастает вторичная культура (субкультура).

3. Диплоидная культура клеток (полуперевиваемая культура). По­лучают их из клеток какого-либо органа животных или человека пу­тем многократных перевиваний. Клетки таких культур не носят злокачественного характера, имеют свойства нормальных клеток и обладают диплоидным набором хромосом. Это морфологически однородная популяция клеток с ограниченным сроком жизни, спо­собные многократно перевиваться. Клетки таких культур ткани могут пассажироватьея в условиях лаборатории до 10 месяцев, но затем погибают, т. е. подвергаются дегенерации и отмирают.

4. Перевиваемые культуры клеток. Это постоянно растущие клет­ки, не имеющие предела роста и размножения, они, как правило, носят злокачественный характер. Получают перевиваемые клетки из различ­ных злокачественных опухолей, удается получать и из нормальных тка­ней путем длительных перевиваний, но в последующем выделенные клетки приобретают злокачественные свойства. Сейчас есть много ви­дов перевиваемых клеток (клетки Хеля, Hep-1, Нер-2, Дейтроид-6 и др.). Перевиваемые клетки можно в условиях лаборатории сохранить и пе­ревивать годами.

Для заражения вируссодержащим материалом выбирают такие про­бирки или матрацы с культурой тканей, в которых сформировался сплошной клеточный монослой. Наиболее широко используют в ди­агностических целях первично-трипсинизированные культуры.

Перед заражением ростовая (питательная) среда сливается, в про­бирку с культурой ткани вносят 0,1 мл вируссодержащей жидкости и 0,9 мл поддерживающей среды, которая обычно бывает аналогична по составу ростовой среде, но без добавления сыворотки, т. к. сыворотка стимулирует рост и размножение клеток, а в данном случае нужно толь­ко поддерживать жизнеспособность клеток без пролиферации их. Пос­ле этого пробирки помещают в термостат в обычном для них положении под углом в 7-10° для дальнейшего культивирования. Поддерживающая среда обеспечивает переживание клеток, но не стимулирует их рост. Иногда заражение проводят контактным способом, т. е. после вне­сения вируссодержащего материала контактируют его с клетками 1-2 часа, а затем сливают материал, наливают новую порцию поддер­живающей среды и ставят в термостат. Этим способом пользуются при заражении культуры ткани патологическим материалом с целью уст­ранения токсичности материала на клетки культуры. После внесения вируссодержащего материала в пробирку с культурой ткани вирус проникает в чувствительные клетки и начинает в них размножаться. Нужно помнить, что не все культуры клеток являются чувствительными ко всем вирусам. В одних культурах ткани размножаются одни вирусы, в других иные, а некоторые вирусы вообще не размножаются. Поэтому надо подбирать вид культуры ткани для конкретного возбудителя.

За зараженными культурами ежедневно наблюдают просмотром под микроскопом и отмечают характер дегенеративных изменений в клетках. Под действием вируса пораженные клетки уже через 24 часа или позже начинают деформироваться, подвергаются деструкции, мо­жет появиться зернистость, округление клеток, вакуоли, в некоторых случаях происходит слияние клеток с образованием большой много­ядерной клетки или образуются симпласты и синцитии. Пораженные клетки могут группироваться в гроздья и затем разрушаются, отпадают от стенки и появляются пустоты в монослое клеток. Все эти измене­ния хорошо видны под микроскопом. Некоторые вирусы (чума сви­ней и др.) могут размножаться в клетках, не вызывая дегенерации и деформации их. Деформация и дегенерация клеток культуры ткани под воздействием различных вирусов может быть различной, но, как правило, всегда носят специфический характер. Способность вируса вызывать определенные морфологические и дегенеративные измене­ния клеток в зараженных культурах тканей принято называть цитопа- тогенным действием вируса (ЦПД). Когда в зараженных культурах

тканей ЦПД вируса будет хорошо и четко выражено и более полови­ны пласта клеток (50%) будет дегенерировано, такие культуры удаля­ют из термостата и хранят до дальнейшего их использования в замо­роженном состоянии в холодильнике при -20°С (в морозилке бытово­го или в специальном низкотемпературном холодильнике). Пробирки с четко выраженным ЦПД для дальнейшей работы, если нужно снять клетки со стенки пробирки и для освобождения вируса из заражен­ных клеток в жидкость, подвергают двух-трех - кратному заморажи­ванию и оттаиванию. Вид монослойной культуры ткани из почек щен­ков собак до и после заражения вирусом гепатита плотоядных пред­ставлены на фото.

Титрование вирусов

Под титрованием вирусов понимают определение количества ви­русов в единице объема вируссодержащего материала (обычно в 1 мл суспензии). Таким образом, Титр - это количество эффективных доз (ЭД) вируса в единице объема вируссодержащего материала (в 1 мл), количество вирусов обычно выражают в БД. Титрование проводят с t целью определения концентрации вирионов в среде, определения и ^ подбора точных доз для заражения, при изготовлении вирусных анти- 5 генов для серологических реакций^/при изготовлении живых и инак- тивированных противовирусных вакцин.

Существуют различные методы титрования, но все они основаны на способности вирусов вызывать инфекционное действие в заражен­ных живых системах (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры тканей) или по гемагглютинирующему действию вируса.

При титровании вирусов на живых системах по инфекционному действию титр выражают количеством средних эффективных доз (ЭД₅₀), содержащихся в 1 мл вируссодержащего материала. ЭД₅₀ - это такая доза, которая вызывает инфекционный эффект (гибель или за­ражение) у 50% зараженных чувствительных систем (50%-ная эффек­тивная доза).

В зависимости от методов титрования, вида живой системы, на ко­торой титруют вирус, и формы проявления инфекционного действия вируса средняя эффективная доза имеет различное выражение, т. е. единицы измерения.

Если определение титра ведут по летальному действию на лабора­торных животных, ее называют ЛД₅₀, т. е. 50%-ная летальная доза.

11ри учете результатов титрации по клиническому проявлению при­знаков болезни или патанатомическим изменениям у зараженных жи­вотных - ИД₅₀, т. е. 50%-ная инфекционная доза.

При титрации вирусов на куриных эмбрионах титры выражают зна­чениями: ЭЛД₅₀ (50%-ная эмбриональная летальная доза) - доза, ко­торая вызывает гибель 50% зараженных эмбрионов; ЭИД₅₀ (50%-ная эмбриональная инфекционная доза) - доза, которая вызывает патана- томические изменения у 50% зараженных эмбрионов. При заражении куриных эмбрионов вирусом оспы на хорионаллантоисной оболочке образуются очажки поражения - оспинки. Считают, что каждая ос­пинка вызывается одним вирионом и это принято считать за одну ос- пообразующую единицу (ООЕ).

При титрации вирусов в культурах ткани титры вируса выражают в цитопатических дозах ТЦД₅₀ (50%-ная тканевая цитоиатическая доза). Это такая доза вируса, которая вызывает цитопатогенное дей­ствие в 50% зараженных про бирках с культурой ткани. При титрова­нии вируса в культурах ткани под агаровым слоем с нейтральротом появляются неокрашенные пятна-бляшки, каждая бляшка является ре­зультатом действия одного вириона и титр в этих случаях выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Таким образом, за 1 ЛД₅₀ считают дозу вируса, убивающую 50% за­раженных животных; за 1 ИД₅₀ - дозу вируса, вызывающую клини­ческие признаки болезни или патологоанатомические изменения у 50% зараженных животных; за 1 ЭЛД₅₀ - дозу вируса, убивающую 50% ку­риных эмбрионов; за 1 ЭИД₅₀ - дозу вируса, вызывающую патанато- мические изменения у 50% зараженных эмбрионов; за 1 ТЦД₅₀ - дозу вируса, вызывающую цитопатический эффект в 50% пробирок с зара­женной культурой ткани.

Количество ЭД₅₀ (ЛД₅₀, ИД₅₀, ЭЛД₅₀, ЭИД₅₀, ТЦД₅₀) вируса, содер­жащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет вы­ражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т = 525 ЛД^мл. Значит в каждом мл вируссодержащего материала содержится по 525 доз вируса, каждая из которых способна убить 50% лабораторных жи­вотных; Т = 10^3,48 ТЦД₅₀/0,1 мл - т. е. в каждом 0,1 мл вируссодержа­щего материала содержится 10^3,48 доз вируса, каждая из которых спо­собна вызвать ЦПД в 50% пробирок с зараженной культурой ткани.

Титр вируса по гемагглютинирующим свойствам устанавливается титрованием в реакции гемагглютинации (РГА) и определяют при этом одну гемагглютинирующую единицу (1 АЕ вируса) - смотри РГА.

При титровании вирусов по инфекционному действию нужно най­ти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объе­ме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД^, а затем рас­считать сколько таких единиц вируса содержится в объеме исходного вируссодержащего материала.

Для проведения титрования из исследуемого вируссодержащего ма­териала готовят ряд последовательных десятикратных разведений от 1:10, т.е. 10¹ до 1:10.000.000, т. е. 10 ⁷, и более (10¹, 10"², 10 ³, 10⁴, 10* и т.д.). Количество разведений зависит от предполагаемого титра вируса, их нужно готовить столько, чтобы последнее (наиболее высокое) разве­дение уже не давало бы инфекционного эффекта. Инфекционное дей­ствие вируса (величина инфекционного эффекта) с каждым разведе­нием убывает пропорционально логарифму разведения (или дозы). То есть при разведении 1:100 (10²) инфекционное действие уменьшается в два раза, если 1:1000 (10"³) в три раза и т. д.

Каждым разведением исследуемого вируссодержащего материала в определенном одинаковом объеме заражают равные группы чувстви­тельных к данному вирусу живых тест-объектов (лабораторных жи­вотных, куриные эмбрионы, культуры тканей). При этом учитывают тропизм и дозы вируса, общепринятые для данного способа введения материала. В каждой группе должно быть не менее 4-6 тест-объектов, т. к. при меньшем количестве статистическая обработка материала будет иметь слишком большую погрешность. Например, титрование вируссодержащего материала проводят по летальному действию ви­руса на белых мышах и каждым разведением заразили по 6 мышей в дозе по 0,2 мл вируссодержащего материала внутрибрюшинно. Резуль­тат заражения в этом случае учитывают по летальному исходу в каж­дой группе мышей и этот результат вносят в таблицу. В результате, например, получили следующие данные (табл. 1).

Таблица 1. Титрование вируса на белых мышах

Разведения вируссодержащего материала	Количество животных в группе	Из них:
		осталось живых	пало
101	6	0	6
102	6	1	5
103	6	2	4
104	6	- 3	3
105	6	5	1
106	6	6	0
107	6	6	0

Из таблицы видно, что разведение 10"⁴ (1:10.000) вызывает 50% ги­бель мышей, что составляет 1 ЛД₅₀ в 0,2 мл вируссодержагцей суспен­зии, разведенной 1:10.000. В таком случае в 0,2 мл неразведенной (ис­ходной) суспензии количество таких доз составит 10.000, а в 1 мл бу­дет в 5 раз больше, т.е. 50.000 ЛД₅₀/мл. Т = 50.000 ЛД₅₀/мл.

Однако, при определении титра вируса очень трудно подобрать та­кие разведения, чтобы одно из них в точности вызывало бы гибель 50% зараженных животных. Часто при титровании количество живых и павших животных бывает неравным. В этом случае для более точного определения титра широко используют в вирусологии метод, предло­женный Ридом и Менчем. Они рекомендуют при титровании брать в опыт большое количество групп по 4-6 чувствительных моделей в каж­дой группе. Отклонение от истинной величины ЛД₅₀, обусловленное применением малого количества подопытных животных в группе, ис­правляется тем, что при исчислении процента летальности опериру­ют данными кумулятивной летальности (кумуляция - накопление).

Метод Рида и Менча основан на логической предпосылке о том, что животные (и другие модели), погибшие при заражении каким-либо разведением вируса, например 10"⁵, погибнут и при заражении более низким разведением (10~⁴, 10"³) вируса. Если же животное не пало при данном разведении, то останется живым и при заражении более высо­ким разведением (10 ⁶,10 ⁷>. На этом основании полученные результа­ты подвергают интерполяции и выражают их в виде кумулятивных данных, на основании которых рассчитывают % летальности.

Например, титрование вируса проводили на белых мышах и полу­чили следующие результаты (см. табл. 2).

Таблиц^2??

Разведения вируссодержащего материала	Количество мышей в группе	Фактические данные		Кумулятивные данные			/о леталь­ности
		выжило -	пало- <	-выж-иле	•>пало	отношение павших к заниженным
ю-1	6	0	6	0	24	24/24	100
ю-2	6	0 i	6	0	18	18/18	100
103	6	1 ч>	5	1	12 А	12/13	92
104	6	2 V	4	3	7	7/10	70
ю-5	6	4	2	7	3	3/10	30
ю-6	6	5	1	12 и	1*	1/13	7,69
107	6	6	0	18	0	0/18	0
108	6	6	0	24	0	0/24	0

При вычислении кумулятивных данных мышей, павших от более высокого разведения, прибавляют к числу погибших от более низкого разведения. Мышей, оставшихся живыми от более низкого разведе­ния, прибавляют к числу животных, не погибших от более высокого разведения (направление показано стрелкой). После получения куму­лятивных данных определяют % летальности. Процент летальности для каждого разведения вычисляют по формуле:

Кол-во павших (кумулятивные данные) % летальности = х100

Кол-во зараженных, т. е. сумма павших

и выживших (кумулятивные данные)

Из таблицы видно, что ни одно из разведений не вызывает 50% ги­бели животных. Средняя эффективная доза оказалась между разведе­ниями 10"⁴ (1:10.000) и 10"⁵ (1:100.000), вызывающими соответственно 70% и 30% летальности. Разведения, при которых % летальности при­ближаются к 50%, называют высшей и низшей критической дозой.

В этом случае ЛД₅₀ (искомое разведение) определяют по формуле:

Ь-50

lgЛД₅₀ = Ь_ёВ- xLgd,

b-a

где ЛД₅₀ - искомое разведения вируса; В - разведение, вызывающее гибель более 50% животных; b - процент летальности, соответствую­щий разведению В; а - процент летальности, соответствующий разве­дению, дающему гибель менее 50% животных; d - коэффициент раз­ведения (у нас разведения 10-кратные, значит коэффициент равен 10). В нашем примере:

lgлд₅₀ = Lg 10⁴ - X Lg10^-4-20/40 х 1=-4-0,5=-4,5LD₅~10-^4r>

Значит, разведение вируса, 0,2 мл которого способно вызвать ги­бель 50% зараженных мышей, равно 10⁴⁵ или 1:10⁴-⁵ Или иначе, в 0,2 мл вируса, разведенного в 10^4,5 раза содержится одна ЛД₅₀, т. е. доза ви­руса, способная убить 50% мышей. Тогда в 0,2 мл исходной вирус- содержащей суспензии таких доз содержится 10^4,5 ЛД₅₀ (т. е. боль­ше во столько раз, во сколько разведен вирусный материал, давший 50%-ный эффект).

Значит титр вируса Т = 10^4,5 ЛД₅₀/0,2 мл, а в1 мл количество ЛД₅₀ будет в 5 раз больше, т. е. Т= 5x10^4,5 ЛД₅₀/мл.

Титр вируса, выраженный числом с дробным показателем степени, обычно в таком виде и оставляют. Его можно легко превратить и в аб­солютную величину с помощью таблицы антилогарифмов (4-х знач- ные математические таблицы Брадиса). По таблице антилогарифмов находят абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛД₅₀. В нашем примере в расчет принимают цифру «4,5». Число «4» показы­вает, что в абсолютной цифре должно быть 5 знаков (4+1). Антилога­рифм цифры 4,5 составляет 3162. Но поскольку в ней только 4 знака, значит, пятый знак приписывают в виде «О» и получается 31620. Значит для нашего примера 1 ЛД₅₀ равна разведению исходного вируса 1:31620. Поэтому выражение титра вируса можно записать Т = 31620 ЛД_5О/0,2 мл. Содержание средних эффективных доз в 1 мл исходного вируссодержащего материала будет в 5 раз больше и соста­вит Т = 5x31620 = 158100 ЛД₅₀/мл.

Методы очистки и концентрации вирусов

В процессе репродукции вируса в клетках происходит накопление его в тканях и жидкостях организма животных, но по отношению к объему массы ткани или другого вируссодержащего материала вируса в них мало. Так, при очистке 1 литра сока листьев табака при мозаич­ной болезни получают только 1 г вирусного препарата, из 1 литра аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, получают 0,02 г очищенного препарата. Следовательно, в любом вируссодержащем материале вирус занимает незначительную долю, а остальное являет­ся балластными веществами для вирулогических исследований. По­этому при проведении вирусологических исследований иногда при­ходится использовать специальные методы для очистки вируса (от ткани, остатков разрушенных клеток, микробов и т. д.), а иногда и кон­центрировать вирусы. Очистку и концентрацию вирусов проводят при изучении морфологии вирусов, для получения очищенных антигенов для серологических реакций, для получения высококачественных и эффективных вакцин.

Различают следующие методы очистки и концентрации вирусов: а) физические методы.

1. Термолизис. Применяется для очистки вирусов от тканевых эле­ментов и бактерий, широко используется в процессе подготовки ви- руссодержащих суспензий из органов для вирусологических исследо­ваний. С помощью этого метода освобождают вирусы из клеток. Вна­чале готовят из органов суспензию растиранием в ступке со стериль­ным песком, затем переносят в центрифужные пробирки и несколько раз замораживают при низких температурах (-20, -50°С) с последую­щими оттаиваниями при температуре 36-37 °С в термостате или при комнатной температуре. После последнего оттаивания суспензию цен­трифугируют при 3-4 тыс. оборотов в минуту 20-30 минут. Вирус бу­дет находиться в надосадочной жидкости. В последующем из такой вируссодержащей жидкости вирус можно концентрировать другими методами (например, методом дифференциального центрифугирова­ния и ультрацентрифугированием).

2. Фильтрация вируссодержащего материала через керамические, асбестовые и мембранные (градоколовые) фильтры. Мембранные (гра- доколовые, миллипоровые) фильтры готовятся из нитроклетчатки с разными размерами пор от 0,1 до 8 мк. При этом методе сначала мате­риал фильтруют через различные бактериальные фильтры (Зейтца, Шамберлана, Беркефельда) и очищают его от балластных веществ (бак­терии, обрывки клеток и других частиц). Затем фильтруют через мем­бранные фильтры с малыми размерами пор, при этом вирусы остают­ся на фильтре (если размер пор меньше размера вирусов), фильтры пропусканием фосфатного буфера отмывают от белка и с целью кон­центрации вируса сам фильтр измельчают или растирают с небольшим количеством стерильного физраствора (или буфера), а затем центри­фугируют для осаждения частичек фильтра. Вирус будет сконцентри­рован в надосадочной жидкости.

3. Дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности. Методы центрифугирования основаны на раз­делении частиц по их массе. Обычно для центрифугирования исполь­зуют охлажденный вируссодержащий жидкий материал и центрифу­ги с охлаждением. При дифференциальном центрифугировании сна­чала центрифугируют материал при 3-4 тыс. оборотов в минуту 30 минут, надосадочную жидкость собирают в другую пробирку и вновь центрифугируют при более высоких оборотах (5-6 тыс.), жид­кость сливают и для осаждения вируса центрифугируют уже затем при 30-60 тыс. оборотов в минуту. Осадок после этого центрифуги­рования ресуспензируют в небольшом количестве среды и исполь­зуют в работе.

При центрифугировании в градиенте плотности используют раз­деление частиц по скорости седиментации в вязкой среде (обычно используют 20-60% сахарозу и др.) и при этом образуются зоны, со­стоящие из частиц одного типа.

4. Методы адсорбции вируса с последующей элюцией. Этот ме­тод основан на способности вирусов адсорбироваться на поверхности некоторых веществ или клеток, а в последующем удаляться (элюиро- вать) с адсорбента при изменении условий (температуры, рН среды и т. д.). В качестве адсорбентов применяют коллоидные растворы не­которых металлов (гидроокись алюминия и др.), каолин, гипс, неко­торые бактерии (например, беспигментные штаммы чудесной па­лочки), эритроциты.

Для адсорбции вируса в осветленную вируссодержащую суспензию вносят соответствующий адсорбент в нужном количестве, хорошо пе­ремешивают, смесь контактируют в течение некоторого времени, за­тем центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, а осадок с ад­сорбированным вирусом растворяют в небольшом количестве среды и элюируют вирус с адсорбента созданием определенных условий (из­менением температуры среды, рН и др.). После этого сорбент удаляют центрифугированием, а вирус остается в надосадочной жидкости.

В вирусологических лабораториях для очистки и концентрации не­которых вирусов в качестве адсорбента используют эритроциты жи­вотных и птиц. Так, например, вирусы гриппа животных и птиц, ин­фекционного энцефаломиелита и др. способны адсорбироваться на по­верхности эритроцитов при низкой температуре (+2, +4°С), а при по­вышении температуры до 37°С элюируют с поверхности эритроцитов в жидкость. Обычно на эритроцитах адсорбируется до 95% вируса из среды, а элюирует 90-100%.

б) химические методы.