1. Микроскопия мазков из патматериала в обычном

СВЕТОВОМ МИКРОСКОПЕ

При многих вирусных заболеваниях в цитоплазме или ядре пора­женных вирусом клеток формируются тельца-включения, которые по форме и величине могут значительно варьировать. В одной клетке может быть от одного до 5-6 телец. Размеры телец-включений зависят от вида вирусов и стадии течения болезни (в самом начале болезни их немного и они мелкие, а затем укрупняются и могут достигать значи­тельных размеров). При коротком инкубационном периоде телец- включений может и не быть.

Обнаружение телец-включений с помощью светового микроскопа в ряде случаев (при бешенстве и др.) служит основанием для поста­новки диагноза. Такие тельца хорошо изучены при оспе, бешенстве, чуме и гепатите плотоядных, ларинготрахеите и др. В световом мик­роскопе при специальных методах окраски (серебрение по Морозову и др.) удается иногда видеть более крупные вирусные частицы, как например, элементарные тельца возбудителя группы оспы.

Для микроскопии в обычном микроскопе из патологического ма­териала готовят мазки или мазки-отпечатки, либо делают гистосрезы из органов. Иногда используют инфицированные вирусом клетки куль­тур тканей, выращенные на покровных стеклах. Наиболее удобны маз­ки-отпечатки, т. к. в этих случаях хорошо будет видно расположение телец-включений в клетке. Мазки и мазки-отпечатки фиксируют на пламени или химическим методом в метиловом спирте, смеси спирта этилового с эфиром поровну, химически чистым ацетоном. При бе­шенстве мазки фиксируют химическим методом 1-2 часа, а ацетоном не менее 10 часов в морозилке холодильника. Мазки-отпечатки и гисто­логические срезы при бешенстве делают из головного мозга (аммоновы рога, мозжечок, продолговатый мозг) и из слюнных желез. Гистосрезы фиксируют по специальной методике в спирте и затем красят.

Фиксированные мазки и отпечатки для выявления телец-включе­ний окрашивают по соответствующим методикам и просматривают затем под микроскопом с увеличением объектива 40х или 90х. Для ок­раски мазков предложено много методов и их модификаций. При бе­шенстве для окраски мазков и отпечатков чаще всего пользуются ме­тодом Муромцева или Михина. Тельца Бабеша-Негри находят в ци­топлазме нервных клеток.

Окраска по Муромцеву, Мазки фиксируют в метиловом спирте или спирт + эфир 1-2 часа, или ацетоном 10-12 часов. Затем поомыва- ют дистиллированной водой и на 5-10 минут погружают в раствор синьки Мансона (2,0 синьки и 5,0 буры растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды), разведенной водой 1:40. После этого краску сливают и тут же мазки, не промывая водой, погружают в 10% водный раствор таннина на 8-10 минут до появления голубоватой окраски. Затем промывают водой, высушивают фильтрованной бумагой, про­водят через смесь из равных частей спирта с ацетоном или спирта с ксилолом и снова высушивают фильтровальной бумагой. Заливают в канадский бальзам. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон. Ядра нервных клеток окрашиваются в

синий цвет, цитоплазма клеток бледно-голубая, а тельца Бабеша-Негри - в бледно-фиолето­вый с розоватым оттенком и с темными включениями.

Окраска по Михину. Фиксированные химическим способом маз­ки окрашивают (после высушивания) 30-40 минут краской Гимза, раз- неденной 1:10 (1-2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды). Натем быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ле/1Яной уксусной кислоты на 30 мл 96° спирта), а затем водой, просушивают фильтрованной бумагой и исследуют. Фон мазка должен быть крас­ным с фиолетовым оттенком, нервные клетки синеватые, ядро клеток черные, а тельца Бабеша-Негри розово-красные с точечными включе­ниями темно-синего цвета.

Есть способы окраски по Селлерсу, Борману, Манну и др.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ (ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ)

МИКРОСКОПИЯ (ЯМ, ФМ)

Среди новейших способов диагностики бактериальных и вирусных заболеваний особое место занимает люминесцентная (флуоресцент­ная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображе­ние на темном нефлуоресцирующем фоне, возможность обнаружения телец-включений, некоторых крупных вирусов и риккетсий, простота и надежность - ценные качества этого вида микроскопии.

Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при ускорен­ной диагностике инфекционных заболеваний, при ускоренной инди­кации возбудителя во внешней среде.

Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно спе­цифичными и высокоточными. По данным ряда авторов этот метод не уступает по показаниям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флуоресцирующие сыворотки или иммуноглобулины. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение и является одним из главных методов при диагностике многих вирусных болезней.

В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюми­несценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками та­ких лучей в люминесцентном микроскопе являются ргутно-кварцевые лампы. Для проведения микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, а также люминесцент­ные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие как ОИ-28 и другие. Результаты, получаемые при работе с лю­минесцентными устройствами, лишь незначительно уступают резуль­татам, получаемым при работе со специальными люминесцентными микроскопами. Как микроскопы люминесцентные, так и устройства должны быть хорошо настроены, комнату для работы затемняют. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании ис­пользуют специальное нефлуоресцирующее масло, заменители его (ди- метилфтолат ДЭТА) или просто дистиллированную воду при водной иммерсии. Настройку микроскопа или устройства проводят согласно прилагаемой к ним инструкции.

Объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, мо­гут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценция), как, например, грибки микроспории, и такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако большинство патогенных микроор­ганизмов и вирусы аутолюминесценцией не обладают, а поэтому маз­ки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы:

1. Метод флуорохромирования (МФ).

2. Методы флуоресцирующих антител (МФА) или иммунофлуо- ресценция (ИФ).

а) Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной ок­раски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски на­зываются флуорохромами, а окраска ими - метод флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители как акридин оранжевый и желтый, аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуо- ресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Продается специальный набор - «Набор красителей для флуоресцентной микроскопии», со­держащий 20 красителей. Растворяют флуорохромы в дистиллирован­ной воде (или буфере), к некоторым из них добавляют фенол до 5%. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000 (ак­ридин желтый 1:500, акридин оранжевый, родамин и корифосфин 1:10.000). Наибольший интерес здесь представляет акридин оранже­вый, который окрашивает ДНК в ярко светящийся желто-зеленый цвет, а РНК в оранжево-красный. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. Чтобы различить проис­хождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное) препараты (маз­ки, мазки-отпечатки) обрабатывают 0,5%-ным раствором ДНК-азы или PIIK-азы в течение 5-10 минут. При этом свечение клеточных ДНК или РНК сразу же исчезает, а вирусные ДНК или РНК продолжают светиться еще 20-30 минут. Это служит доказательством специфично­сти вирусных нуклеиновых кислот.

Метод флуорохромирования широко применяется при диагности­ки бактериальных болезней и для этого имеются разработанные ВИЭВ рекомендации для окрашивания различных микробов и спор.

б) Методы флуоресцирующих антител (МФА), иммунофлуо- ресценция (ИФ). МФА (ИФ) основаны на принципе специфическо­го взаимодействия антигена со специфическими антителами, но ис­пользуют здесь антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген специ­фический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с дан­ным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение ан­тигена происходит не за счет окрашивания его, а за счет связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся они не в пробирках, а на предметном стекле (в мазках) и используются флуоресцирующие антитела. В настоящее вре­мя налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма-глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструк­ции по применению с указанием титра антител. Растворяют их для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в хо­лодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки вы­пускают в жидком виде.

МФА находят широкое применение при диагностике многих ви­русных болезней - бешенство, грипп, болезнь Аусеки, вирусный гепа­тит плотоядных и чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.

Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 раз­новидности:

1. Прямой МФА (предложен Кунсом и Капланом, 1942, 1950 гг.).

2. Непрямые МФА:

а) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.) ;

б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сы­воротки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).

Прямой МФА. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применя­ется в практической работе.

Сущность и техника прямого МФА заключатся в том, что на пред­метное стекло с фиксированным на нем м^шГ(или мазком-отпечат­ком) из вируссодержащего материала наносят небольшое количество (2-3 капли) специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуо­ресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина, в рабочем титре и выдерживают во влажной камере (в чашке Петри с кусочком ваты, смоченной водой) в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают буферным солевым раствором и дистил­лированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под им­мерсионной системой в люминесцентном микроскопе. Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», ко­торый не смывается при промывании мазка и при микроскопии пре­парата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антиге­на за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител. Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не оыло (от здоровых животных), то свече­ния антигена не будет и поле зрения будет темным потому, что анти­тела не связались с фиксированным мазком и смылись при промыва­нии мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные. Мазки и мазки-отпечатки нужно готовить тонкие, высушивают мазки на воздухе и фиксируют химическим спо­собом (ацетон, метиловый спирт, спирт + эфир), можно фиксировать пламенем. В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение при просмотре в ядрах или цитоплазме пораженных виру­сом клетках в виде различных гранул и телец-включений, а если клет­ка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон.

К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом ме­тоде в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь спе­цифическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.

Непрямые МФА называются так потому, что флуоресцирую­щие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посред­ника, в качестве которого может быть специфическое вирусному ан­тигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комп­лемент (при антикомплементарном методе). Непрямые МФА связа­ны с обработкой мазка в два этапа: вначале наносят специфическую вирусному антигену нефлуоресцирующую сыворотку (при антикомп­лементарном методе и комплементе одновременно) и контактируют 30-40 минут во влажной камере при 37° С, затем промывают буфером и водой (или просто водой ) и наносят флуоресцирующую сыворотку специфичную противовирусным неокрашенным антителам (при ан­тивидовом методе) или комплементу (при антикомплементарном ме­тоде), опять контактируют 30-40 минут во влажной камере в условиях термостата, промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люми­несцентным микроскопом.

Непрямой МФА с использованием антииилоной флуорес­цирующей сыворотки» На фиксированный мазок или отпечаток на­носят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) им­мунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдержи­вают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется анти­ген специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «анти­ген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится в люминесцентном микроскопе. Поэтому ма­зок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сы­вороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или другие виды животных сывороткой или глобулинами того вида животных, на кото­рых получают специфическую для вируса гипериммунную нефлуо­ресцирующую сыворотку и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высу­шивают на воздухе и смотрят. Антитела из флуоресцирующей анти­видовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплек­се Аг + Ат и образуется новый комплекс «Аг (вируса) + Ат противо­вирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антиви­довой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки».

При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярко салатно-зеленым цветом за счет флуо­ресцирующих антител антивидовой сыворотки.

Если же в первом этапе обработки компоненты были неспецифич­ны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг + Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не свяжутся, при промыва­нии мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.

Непрямой МФА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится реакция на пред­метном стекле и вместо гемолитической системы используют флуо­ресцирующую антикомплементарную сыворотку. Получают антиком­плементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов натив- ной свежей сывороткой морской свинки (комплемент) и у кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специ­фичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу) и в реакцию будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементар­ную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ-ем и получает­ся флуоресцирующая сыворотка.

На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят спе­цифическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуорес- цирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, кон­тактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут (про­ходит реакция в баксистеме), а затем промывают водой. В случае, если, как и в пробирочной РСК, антиген в мазке будет специфичен нанесен­ным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат им­мунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но све­чения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомпле­ментарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микро­скопом. Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сы­воротки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противови­русной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в резуль­тате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом. Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.

3. МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(ИФА)

Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА ос­нован на использовании для диагностики антител меченых ферментами. Для метки применяют такие ферменты как пероксидазу хрена, щелоч­ную фосфатазу и др. Используют ИФА для выявления и идентификации как вируса, так и антител к нему.

Для идентификации вируса иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимический и твердофазный. * .

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция, аналогична методу иммунофлуоресцен^ии (МФА), но от­личается тем, что для постановки реакции используются антитела мече­ные не флуорохромом, а ферментом и учет реакции проводят просмот­ром под обычным световым микроскопом. В этом варианте ИФА используются антитела, меченые нероксидазой хрена. Выявляют вирусный антиген (вирусы) в мазках-отнечатках из органов, мазках крови, гистосрезах, культурах клеток зараженных вирусом. Ставят им- мунопероксидазную реакцию по прямому и непрямому варианту.

а) Для ^выявления вируса по прямому варианту используют мече­ные пероксидазой специфические вирусу антитела. Такие меченые антитела (конъюгаты) готовят в учреждениях биологической промыш­ленности.

Мазки-отпечатки из патматериала, культуры клеток, выращенные на покровных стеклах и зараженные вирусом, фиксируют при -10°, -20°С ацетоном, высушивают на воздухе и затем на мазок наносят иммуно- пероксидазный конъюгат в рабочем титре, инкубируют при 37°С во влажной камере 1-2 часа, 15 минут промывают физраствором, затем споласкивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Затем наносят несколько капель субстрата^О^бсщш^- это вещества, которые под действием ферментов разлагаются, образуя цветной про­дукт ферментативной реакции. Для пероксидазы хрена в качестве суб­страта применяют диаминобензидинтетрахлорид, 5-аминосалицило- вую кислоту, ортотолуидин, ортодимилендиамин. Чаще используют диаминобензидинтетрахлорид. Мазок с нанесенным субстратом инку­бируют 5-10 минут, промывают 10-15 минут физраствором, споласки­вают дистиллированной водой. Учет результатов проводят под обычным световым микроскопом. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в мазках, после нанесения иммунопероксидазного конъюга- та образуется комплекс «Аг + Ат», меченый ферментом. После нанесения на препарат субстрата последний под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментации, хорошо видимый в световом микроскопе. Образуется при разложении продукт реакции голубого цвета, который быстро переходит в коричневый и будут видны или равномерное диффузное желто-коричневое окрашивание или гранулы коричнево-черного цвета. В контроле окрашивания не будет. Также об­рабатывают и гистосрезы, но контакт конъюгата удлиняют до 6 часов.

б) При непрямом методе ИФА используют антивидовые иммуно- пероксидазные конъюгаты (антивидовые антитела меченые перокси- дазой). На фиксированный охлажденным ацетоном препарат (мазок- отпечаток, мазок, гистосрез) наносят первоначально специфическую искомому антигену сыворотку, контактируют 1-2 часа во влажной ка­мере, промывают физраствором 5 минут, высушивают на воздухе, за­тем наносят антивидовой иммунопероксидазный конъюгат и инкуби­руют при 37°С 1-6 часов во алажной камере и далее как и при прямом методе. Учет проводят также под световым микроскопом.

Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) основаны на применении антител (или антигена) фикси­рованных на нерастворимых носителях. В качестве носителей исполь­зуют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или кера­мические пробирки и микропанели с плоским дном, латекс.

Применение ТФР1ФА используется как для обнаружения ви­русного антигена, так и для специфических антител. В этом мето­де используют^онщ^ат^ меченые как пероксидазой хрена, так и щелочно-фосфатазные.

Для выявления вируса с помощью данного метода в вируссодержа- щем материале наиболее часто используют метод двойных антител или 4сэндвич». Для этого лунки полистироловых микропанелей сенсиби­лизируют гамма-глобулином, выделенным из специфической к иссле­дуемому антигену сыворотки. В лунки вносят по 0,2 мл гамма-глобу­лина в нужной концентрации в натрий-карбонатном буфере с рН-9.6,

йнкубируют 1 час при 37°С и затем оставляют на ночь при 4°С. Наутро риз лунок сливают раствор гамма-глобулина, промывают лунки пане­ли 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером с рН-7.4, затем в лун- ки вносят по 0,2 мл раствора, соде]э:яш^ антиген, и

инкубируют 2 часа при 37°С. В контрольные лунки вносят заведомо известный положительный и негативный антигены. Микропанели за­тем промывают 3 раза по 5 минут калий-фосфатным буфером. Затем в лунки вносят по 0.2 мл иммуноферментного конъюгата и инкубируют 1-2 часа при 37°С, промывают калий-фосфатным буфером 3 раза по 5 минут и вносят в лунки по 0.2 мл раствора субстрата (для иммуно- пероксидазного конъюгата применяют ортофенилендиамин или 5-ами- носалициловая кислота, а для щелочно-фосфатазного конъюгата р-нит- рофенилфосфат), инкубируют в темноте при комнатной температуре 5-30 минут. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2Н H2S04 (для пероксидазы) и ЗМ NaOH (для щелочной фосфатазы). Учиты­вают реакцию визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов. При использовании субстрата ортофенилендиамина поло­жительные образцы имеют оранжево-коричневую окраску, а при 5-ами- носалициловой кислоты опытные образцы окрашиваются в интенсив­но-коричневый цвет, контрольные образцы или неокрашенные, или слабо-желтые. При использовании щелочной фосфатазы опытные об­разцы окрашены в желтый цвет. Учет реакции ИФА можно проводить с помощью спектрофотометра.

4. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

При диагностике некоторых вирусных болезней и особенно для изу­чения морфологии вирусов в настоящее время в ряде крупных науч­но-исследовательских учреждений с успехом применяют электронную* микроскопию. Разрешающая способность электронных микроскопов достигает 2 А (у световых микроскопов 2500 А и больше), что практи­чески дает возможность видеть все вирусы. В отличие от светового в электронном микроскопе освещение идет сверху вниз и изображение получается за счет потока электронов, длина волны которых во много раз меньше длины волны света.

С целью выявления вируса в исследуемом материале препараты для электронной микроскопии готовят методом негативного контрастиро­вания (применяется для выявления свободных частиц вируса и изуче­ния его морфологии после очистки и концентрации вируссодержащей

суспензии). Для этого медные электронно-микроскопические сеточки с коллодиевой пленкой-подложкой помещают на несколько секунд в каплю вируссодержащей суспензии. Затем промывают 2-3 каплями дистиллированной воды и подвергают негативному контрастирова­нию. Для этого на препарат наносят каплю 10%-ного раствора фосфор- новольфрамовой кислоты (рН-7,0) или 5%-ного раствора уксуснокис­лого уранила. Фильтровальной бумагой удаляют лишний контрасти­рующий раствор и сеточку просматривают в электронном микроскопе.

Используют также методы напыления с применением тяжелых ме­таллов (золото, палладий, уран), которые распыляют в парообразном состоянии под определенным углом на поверхность исследуемого пре­парата. Для обнаружения вируса в клетках используют метод ультра­тонких срезов. Для этого вируссодержащий материал предварительно фиксируют химическими или физическими методами. Основным хи­мическим фиксатором является четырехокись осмия, из физических фиксаторов часто применяют высушивание на воздухе и лиофилиза- цию. Фиксированные кусочки ткани обезвоживают в спирте или ацетоне и заливают в эпоксидные смолы (эпон, аралдит др.). Сре­зы толщиной 50-200 А из залитых кусочков ткани готовят на ультра­микротомах с помощью алмазных или стеклянных ножей.

Методы выделения (изоляции) вирусов

При диагностике вирусных болезней, а также и для других целей, часто возникает необходимость выделить вирус из патологического ма­териала, взятого от больного или павшего животного. Для этого взя­тый материал проверяют на возможную бактериальную загрязненность микроскопией и посевом на среды. Если материал плотный (кусочки органов), готовят на физиологическом растворе суспензию (как было ранее описано). Для профилактики возможного бактериального заг­рязнения добавляют антибиотики. Выделяют вирусы путем введения исследуемого патологического материала (т. е. заражением) чувстви­тельным лабораторным животным, куриным эмбрионам или в куль­туры тканей. Во всех случаях при сомнительных результатах необ­ходимо провести несколько (не менее трех) пассажей. В результате этого происходит адаптация вируса к данной биологической модели и ири последующих пассажах будут видны более четко клиническая кар­тина или изменения в куриных эмбрионах и в культуре тканей. Одно­временно при пассажировании исключаются возможные токсические свойства патологического материала (т. е. наличие в материале токси­нов), так как действие токсинов на 2-3 пассаже проявляться уже не будет, а вирус за это время адаптируется и накапливается.

В опыты по выделению вирусов обычно берут известные чувстви­тельные биологические модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры тканей), а если вирус неизвестен, то одно­временно берут несколько моделей и тем самым подыскивается чув­ствительная для данного вируса биологическая модель. В этих случа­ях используют в опыте несколько видов лабораторных животных, куриные эмбрионы при различных способах заражения и несколь­ко видов культур тканей.

ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ (БИОПРОБА)

1.Лабораторные животные очень широко применяются при диагнос­тике вирусных болезней. Наиболее часто в качестве подопытных жи­вотных используют белых мышей, белых крыс, морских свинок, хомяков и хорьков, реже применяют голубей, кур и в ряде случаев используют для биопробы собак, поросят, телят, овец и др. животных.

Выбор лабораторных или других животных и способов заражения зависят от вида вируса, который предполагается выделить. В случаях, когда невозможно установить вид предполагаемого вируса, заражают несколько видов животных. Если лабораторные животные нечувстви­тельны к данному вирусу (чума свиней, инфекционная анемия лоша­дей и др.) заражают основного хозяина.

Для проведения биопробы животных берут здоровых, приобретен­ных из заведомо благополучного хозяйства или питомника, воспри­имчивых к изучаемому заболеванию. Большое значение имеет возраст, т. к. к вирусам наиболее чувствительны молодые животные, а в неко­торых случаях используют даже сосунов. Животные должны получать полноценный рацион и содержаться в надлежащих санитарных усло­виях, имеет значение в некоторых случаях и пол. Приобретенных жи­вотных перед использованием их для заражения обязательно выдер­живают в карантине, а перед опытом тщательно осматривают и иногда измеряют температуру тела (нормальная температура тела у белых мышек 37.0-39.0°С, у кроликов 38.7°-39.5°С, у морских свинок и бе­лых крыс 38.5°-39.5°С, у кур и голубей 41.5°-41.8°С, у собак и кошек 38.0°-38.5°С). Содержат лабораторных животных в специальных клет­ках и в отдельном помещении. После заражения животных маркиру­ют (метят) и содержат отдельно от здоровых. Одним и тем же матери­алом в каждом опыте обычно заражают несколько животных с тем, чтобы исключить возможную индивидуальную резистентность подо­пытных животных.

В настоящее время для большинства вирусов подобраны чувстви­тельные лабораторные животные и установлены эффективные спосо­бы введения вируссодержащего материала. Известно, что вирусы обладают тропизмом к определенным тканям в организме. Этим и определяется выбор способа введения. Так, например, для выделе­ния нейротропных вирусов заражение проводят в мозг, при выделе­нии респираторных - интраназально, дерматропных - на кожу или внутрикожно и т. д. Поскольку при первичном заражении животных они могут не заболеть, то через 6-8 дней здоровых на вид зараженных животных убивают, а их органы используют затем для заражения сле­дующей партии животных, делают обычно три бессимптомных (слепых) пассажа. Результаты выделения вируса считают положи­тельными в тех случаях, когда у животных после соответствующего инкубационного периода развиваются клинические признаки болез­ни и когда это заболевание удается передавать от одного животного к другому при пассажировании.

При заражении подопытных животных нужно обеспечить соответ­ствующую их фиксацию. Это достигается при помощи специальных приспособлений (доски, стенки и т. д.) или же животное держит по­мощник. Кролика помощник берет правой рукой за кожу спины, под­нимает и закладывает его задние лапы под мышку левой руки. В таком положении кролик оказывается крепко зафиксированным. Можно фиксировать кролика и другим способом: сидя на стуле, взять его зад­ние лапы, поднять, а голову и передние лапы зажать между ногами. Для фиксации морских свинок в одной руке зажимают задние лапы, а в другой - передние и голову. Мышей для фиксации одйой рукой бе­рут за хвост, а другой захватывают за кожу в области верхней части шеи, поднимают и в таком положении держат в момент заражения. Мри работе с мышами можно обходиться и без помощников, используя пинцеты Пиана.

Инструментарий, необходимый для заражения (шприцы, иглы, пин­цеты), стерилизуют кипячением, при наборе в шприц заражающего ма­териала нужно опасаться его разбрызгивания. Для этого после того как материал в несколько большем, чем требуется для заражения, количе­стве будет набран в шприц, последний поворачивают вертикально вверх иглой и, надев на кончик иглы вату, давлением на поршень осто­рожно выпускают в нее пузырьки воздуха и избыток материала. Вату затем пинцетом сбрасывают в дезраствор. Место введения материала тщательно обрабатывают: шерсть выстригают, кожу протирают спир­том и смазывают йодом.

В лабораторных исследованиях наиболее часто пользуются следую­щими методами (способами) введения вируссодержащего материала:

а) подкожный метод - материал вводят под кожу в области спины, области бедра, мышкам в области поясницы у корня хвоста. Кожу на месте введения оттягивают пальцами и вводят материал;

б) внутримышечный метод - материал вводят в толщу мышц в об­ласти бедра или груди (у птиц);

в) внутрикожное заражение - материал тонкой и острой иглой вво­дят в толщу кожи и на месте введения образуется бугорок;

г) внутрибрюшинный метод - животное фиксируют в вертикаль­ном положении вниз головой и материал вводят в области паха (луч­ше, если животное перед заражением было долго некормленным);

д) внутривенное заражение (интравенозный метод) - материал вво­дят тонкой иглой мышам и крысам в хвостовую вену, кроликам - в краевую вену уха, морским свинкам в сердце. Материал не должен со­держать крупных частиц и пузырьков воздуха. Чтобы лучше вырисо­вывалась вена, рекомендуется протирать ксилолом или бензолом;

е) заражение животных в нос (интранозальный метод) - для введе­ния материала лабораторных животных предварительно наркотизи­руют в банке с эфиром и в результате наступает глубокий сон, но не продолжительный. Материал вводят в обе ноздри по 2-3 капли;

ж) заражение в мозг (интрацеребральный метод) - материал вво­дят в мозг головной в толщу или под твердую мозговую оболочку. У крупных животных делают предварительно трепанацию черепа, мыш­кам вводят иглой выше и левее или правее точки пересечения линий: средней сагитальной и линии, соединяющей верхние углы орбиты глаз. Доза для мышей 0,02-0,03 мл, для кроликов 0,3-0,5 мл;

з) заражения в переднюю камеру глаза - материал вводят тонкой иглой, после предварительного обезболивания глаза кокаином, через роговицу на границе с белочной оболочкой и после того как стечет не­сколько капель жидкости из передней камеры глаза. Вводят материал в дозе 0,05-0,1 мл в один глаз, другой остается в качестве контроля;

и) заражение в кончик носа (в верхнюю губу) мышек - при бешенстве.

Кроме перечисленных методов, в ряде случаев экспериментальным животным скармливают зараженные корма (алиментарный метод), на­носят инфицированный материал на кожу, на конъюнктиву или рогови­цу глаза, заражают субокципитально в спинномозговую жидкость и т.д.

Гибель зараженных животных в первые сутки возможна от травмы. Срок наблюдения за зараженными животными устанавливают из рас­чета в 2-3 раза превышающий максимальную длительность инкубаци­онного периода при этом заболевании. В это время, при необходимос­ти, можно выполнять серологические прижизненные обследования их.

Животных, павших при экспериментальном заражении, немедлен­но вскрывают, проводят патологоанатомическое исследование и соби­рают материал для других вирусологических исследований или для перезаражения. Вскрытие проводят стерильными инструментами со строгим соблюдением асептики и личной профилактики. Для исклю­чения бактериальной инфекции проводят посевы материала на пита­тельные среды для аэробов и анаэробов. Трупы после вскрытия и взятия материала утилизируют сжиганием в печах или автоклавированием.

Кроме выделения вирусов лабораторные животные широко при­меняются и для других целей: изучение патогенеза и патоморфологии при вирусных инфекциях, для титрования вирусов, для получения живых ослабленных противовирусных вакцин и гипериммунных сы­вороток, для аттенуации (ослабления вирулентности) вирусов, для сохранения и поддержания вирусов в условиях лаборатории и т. д.

2. ВЫДЕЛ ЕНИЕ ВИРУСОВ НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на кури­ных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бакте­рий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особен­но оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, яв­ляется благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), ус­пешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая мак­роскопически видимые изменения. Различные представители миксо- вирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную по­лость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрио­нах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (лег­горн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям.

Для инкубирования отбирают оплодотворенные свежеснесенные яйца или не более 6-10 дней после снесения. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть яйца перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования. Инку­бируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и до­ступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена выни­мать па 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влаж­ности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°С.

Рис. 1. Строение куриного эмбриона.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирова­ния, происходит закладка головного мозга, скелета. На 5-е сутки в гла­зах эмбриона появляется темный пигмент, отмечается сильный рост глаз, что хорошо видно при просвечивании на осветителе. На 8-е сут­ки эмбрион принимает сходство с цыпленком, но меньших размеров. Начиная с 12 дня у эмбриона хорошо видна пульсация главной аллан- тоисной вены. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней пред­ставлено на схеме (рис.1).

Для заражения эмбрионы используют с однодневного и до 13-ти суточного возраста, наиболее часто применяют в возрасте 7-12 дней. Для заражения нужны стерильные условия и поэтому работу с кури­ными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжай­шим соблюдением асептики.

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хоро­шо выраженной подвижностью. С этой целью все эмбрионы тщатель­но просматривают в затемненной комнате на овоскопе или с помощью осветителя к микроскопу (ОН-19). При просмотре устанавливают жизнеспособность эмбрионов и место расположения эмбриона в яйце. Жизнеспособные эмбрионы являются подвижными, сосуды хорионал- лантоисной оболочки наполнены кровью и четко контурированы, с 12-го дня видна пульсация главной аллантоисной вены. Если же эмб­рион погиб, его самостоятельные движения отсутствуют, в сосудах кровь скапливается только в отдельных участках, сосуды нечеткие, прерывистые, контуры их расплывчаты, края нерезкие. Во время про­свечивания эмбрионов перед заражением на скорлупе простым каран­дашом обрисовывают пугу (воздушную полость), ход крупных крове­носных сосудов и место предлежания эмбриона, т. е. участок на скор­лупе, где ближе всего к ней лежит эмбрион. Отметка пуги, места пред­лежания эмбриона и хода крупных кровеносных сосудов затем служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала в момент заражения.

Отобранные для заражения куриные эмбрионы переносят в бокс, где и проводят с ними работу. Перед заражением скорлупу по месту введения материала дважды обрабатывают йодированным спиртом и обжигают.

Рис. 2. Способы заражения куриных эмбрионов.

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различ­ные способы введения вируссодержащего материала: