Министерство сельского хозяйства и продовольствия РФ

Департамент кадровой политики и образования

Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Лабораторная диагностика вирусных болезней у животных

Учебное пособие (издание третье, дополненное)

Санкт-Петербург 1998

УДК 619:616.98:578-078

В пособии изложены общая характеристика вирусов, описана виру­сологическая лаборатория, методика взятия и подготовки патологичес­кого материала к исследованию, методы обнаружения, выделения и идентификации вирусов.

Учебное пособие предназначено для студентов очного и заочного факультетов, ветеринарных врачей ФИ К и преподавателей.

Автор: П. Ф. Сонин

Утверждено методической комиссией академии 20 мая 1998 г Протокол № 4.

© Ленинградский ветеринарный институт, 1989 г.

€> Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины, 1998 г. с изменениями

Введение

Вирусология, как самостоятельная наука, сформировалась сравни­тельно недавно и берет свое начало с открытия Дмитрия Иосифо­вича Ивановского, который в 1892 году при изучении мозаичной болезни табака в Никитском ботаническом саду (в Крыму) впер­вые доказал, что болезнь табака вызывается фильтрующимися мик­роорганизмами, невидимыми под обычным световым микроскопом. Ивановский является основателем учения о вирусах - вирусологии.

Вирусология - биологическая наука, занимающаяся изучением ви­русов и болезней, вызываемых вирусами. Вирусы свое название полу­чили в те времена, когда считали, что болезнь от укуса змеи и бешеной собаки имеет одинаковую причину - попадание в организм ядовитого вещества, т. е. вируса. Слово «вирус» переводится как яд животного происхождения.

Такое название было дано, когда еще не знали, что вирусы - живые существа. Сейчас накоплен большой материал, который подтверждает, что с биологической точки зрения вирусы представляют собой простей­шие формы жизни, в которых основные жизненные процессы совер­шаются на молекулярном уровне. Вирусы способны размножаться в живых клетках, передавать признаки по наследству и изменяться под влиянием внешних условий, следовательно, вирусы - это особая груп­па живых существ, простейшая неклеточная форма жизни. Из всех су­ществ, обитающих на земле, наиболее просто организованы вирусы. Они занимают особое положение в биосфере, находясь на границе живой и неживой природы.

Один из ведущих советских вирусологов академик В. М. Жданов считает, что современные вирусы являются потомками простейших живых организмов, которые на определенных этапах эволюции при­способились к существованию за счет клеточных организмов и стали внутриклеточными паразитами.

Сейчас известно более 3000 вирусов и в том числе более 500 пора­жающих человека и животных»

Общая характеристика вирусов

В настоящее время под определением «вирусы» понимают осо­бую группу живых существ, патогенных для человека, животных и растений и имеющих кардинальные биологические отличия от воз­будителей микробной и риккетсиозной природы. Вирусы также, как и бактерии, являются живыми организмами, однако отличаются от них более низкой организацией и чрезвычайно малыми размерами. В отли­чие от бактерий и риккетсий вирусы характеризуются следующими свойствами:

1. Вирусы имеют малую величину, а поэтому обладают свойствами фильтроваться через все существующие бактериальные фильтры (Зей- тца, Беркефельда, Шамберлана). В связи с этим их раньше называли фильтрующиеся вирусы (сейчас слово «фильтрующиеся» не употреб­ляют в связи с тем, что имеются фильтрующие формы бактерий и раз­работаны фильтры, задерживающие вирусы). Измеряются вирусы в нанометрах (нм), в то время как бактерии имеют размер от 0.3 до 10 микрометров (мкм). Нанометр - 1/1000 мкм или 0.0000001 мил­лиметра. Поскольку вирусы так малы, их под обычным микроскопом не видно. Величина вирионов колеблется от 8 до 332 им.

2. Вирусы являются строгими (облигатными, абсолютными) внут­риклеточными паразитами, т. е. могут размножаться только в живой растущей клетке с большим потенциалом обмена, вне клетки они лишь некоторое время могут сохраняться, но не размножаться. 11оэтому моло­дые организмы к болезни более восприимчивы и болезнь у них протека­ет острее. Для постановки биопробы обычно берут молодых животных или даже сосунов. Вирусы на питательных средах, применяемых в бак­териологии, не растут, им нужны обязательно живые клетки. Поэтому для выделения, сохранения и культивирования в условиях лаборато­рии используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эм­брионы (КЭ) и клеточные культуры тканей (т. е. растущие вне орга­низма клетки из органов животных, человека и птиц).

3. Вирусы не имеют собственного обмена веществ (метаболизма), живут и размножаются за счет ферментов и веществ клетки, в которой они паразитируют. Из материала клетки происходит формирование новых вирионов. У некоторых вирусов обнаружены ферменты, с по­мощью которых вирусы проникают в клетки. Ферментативные си­стемы у внеклеточного вируса еще не выяснены и многие ученые считают, что большинство вирусов, находясь вне клетки, не содержат своих ферментов.

4. При паразитировании в клетках вирусы вызывают образование специфических телец-включений внутри клеток. Располагаются та­кие тельца-включения либо в ядре, либо в цитоплазме клетки (внутриядерные или цитоплазматические тельца). Обнаружение те­лец-включений под микроскопом имеет большое диагностическое зна­чение (при бешенстве, оспе, гриппе, чуме и вирусном гепатите плотояд­ных, ларинготрахеите и бронхите кур и др.). Природа этих телец еще не вполне ясна, но в них содержится вирусный антиген и доэтому боль­шинство авторов склонны считать, что это скопление вирусных частиц. Чем больше телец-включений в патологическом материале, тем резуль­тативнее проходит биологическая проба.

5. Вирусы не имеют клеточного строения и они просто устроены, нет цитоплазмы, рибосом и ядра. Они, как правило, в центре содержат нуклеиновую кислоту в виде спирали, которая может быть вытянута (у палочковидных вирусов) или дополнительно свернута в форме клуб­ка (у сферических вирионов). Снаружи нуклеиновая кислота покрыта белковой оболочкой, состоящей из молекул белка. Каждая субъеди- ница оболочки называется капсомером, а вся белковая оболочка - капсидой. В связи с этим всю вирусную частицу (вирион) называли нуклеокапсид, а сейчас называют «вирион». Укладка капсомеров на вирусной нуклеиновой кислоте у разных вирусов неодинакова. Если вирусная нуклеиновая кислота имеет вид спирали (у палочковидных вирусов), то капсомеры располагаются по ходу спирали, окружая нук­леиновую кислоту в виде чехла (муфты). В этом случае говорят о спи­ральном виде симметрии. Если же :^та нуклеиновая кислота имеет вид спирали, свернутой в клубок (как свернутый морской канат), то капсо­меры располагаются снаружи этого клубка в виде правильного многогран- иика (у сферических вирусов). В этом случае говорят о кубическом типе симметрии. Имеются вирусы (бактериофаги) с комбинированным ти­пом симметрии.

Нуклеиновая кислота вируса является носителем вирулентных и наследственных свойств, а белок играет защитную роль для нуклеино­вой кислоты и имеет значение как антиген. По строению белка вирусы различны и антигенное строение их поэтому неодинаково.

У крупных вирусов кроме этих структур имеется еще вторая (ли- поиротеидная) оболочка, называемая суперкапсидой или «пеплос». Липиды, входящие в состав этой оболочки, имеют обычное клеточ­ное происхождение.

Нуклеиновая кислота занимает 20-45%, а остальное белок. В со­став белков вируса входит до 18 аминокислот. В химическом отноше­нии вирусы содержат нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и могут быть жиры.

6. Вирусы, как правило, содержат только одну из нуклеиновых кислот - либо ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), либо РНК (рибонуклеиновая кислота). Поэтому вирусы делят на ДНК и РНК-содержащие (Рибовира и Деоксивира). В отличие от других организмов у вирусов ДНК и РНК могут быть одно или двухнитча- тые. Цепь нуклеиновой кислоты состоит из нуклеотидов, которые в химическом отношении состоят из остатка фосфорной кислоты, азо­тистых оснований (пуриновых и пиримидиновых) и углеводов (рибо- за или дезоксирибоза).

7. Вирусы имеют разобщенный (дисъюнктивный) тип размноже­ния, который заключается в том, что при внедрении в живую клетку вируса клетка начинает продуцировать вирусный белок и вирусную нуклеиновую кислоту за счет своих запасов и материалов, но синтези­руются они в разных участках клетки (т. е. разобщенно), а затем идет их компанация (соединение, сборка) и образуется новая вирусная ча­стица - вирион. Процесс внедрения вирусов в клетку у различных ви­русов происходит по разному. Так, бактериофаги сначала прикрепля­ются к оболочке бактерии, а затем ферментируют оболочку в месте прикрепления и впрыскивают в клетку свою нуклеиновую кислоту. Другие вирусы проникают в клетку за счет пиноцитоза (виропексис), т. е. фагоцитируются клеткой как чужеродное вещество, замаскирован­ное белком. Внутри клетки белок ферментируется и вирусная нуклеи­новая кислота освобождается. Как в первом случае, так и во втором, следовательно, важно, чтобы в клетку попала вирусная нуклеиновая кислота. Попавшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота блокиру­ет клеточную нуклеиновую кислоту (в частности ДНК) и заставляет клетку работать на себя. Клетка из своих резервов начинает продуци­ровать вирусную нуклеиновую кислоту и вирусный белок. Вирусный белок синтезируется в рибосомах клетки, а вирусная нуклеиновая кис­лота в ядре или цитоплазме клетки. Затем они соединяются по принципу комплементарности и формируется новый вирус (чаще у цитоплазматической мембраны клетки). Каждая зараженная клет­ка продуцирует тысячи новых вирионов, способных заразить сосед­ние здоровые клетки. Размножение вирусов называют репродукцией.

8. Вирусы слабо устойчивы к гниению и нагреванию. В гниющих органах и тканях, а также в другом патологическом материале, вирусы быстро инактивируются и такой патматериал становится мало при­годным для проведения вирусологических исследований. Поэтому при взятии материала для лабораторных исследований важно, чтобы он был свежим.

Нагревание действует также губительно на вирусы. Температура 70-80° С инактивирует многие вирусы в течении нескольких минут, а кипячение убивает вирусы моментально.

6. Вирусы устойчивы к холоду и хорошо переносят минусовые тем­пературы. В условиях лаборатории вируссодержащий материал сохра- няют в морозилке обычного холодильника (-20°, -15° С), однако более длительно сохраняется вирус в низкотемпературных холодильниках ири -70° С или в жидком азоте. Вирусы хорошо переносят высушива­ние из замороженного состояния под вакуумом (лиофильное высуши­вание), лиофильно высушенные вирусы можно сохранять биологичес­ки активными несколько лет.

Устойчивы вирусы к действию многих ныне выпускаемых антиби- отиков. Поэтому при проведении вирусологических исследований для освобождения патологического материала от посторонней микрофло­ры и грибков широко применяют антибиотики (пенициллин, стреп­томицин, нистатин), которые добавляют в вируссодержащий матери­ал и различные среды для профилактики бактериального и грибково­го загрязнения.

50%-ный раствор глицерина используют для консервирования ви­ру ссодержащих материалов.

6. У многих вирусов выражен тканевой тропизм, т. е. локализация и определенных тканях организма и по этому признаку вирусы под­разделяются на дерматропные, пневмотропные, висцеротропные, эн- теротропные, нейротропные и пантропные. Однако тропизм носит не­постоянный характер и может зависеть от вида животного, возраста и стадии течения заболевания. Тропность вирусов учитывают при выбо­ре патологического материала для проведения лабораторных исследо­ваний. По мнению многих авторов у чувствительных к вирусу клеток имеются клеточные рецепторы, которые комплементарны, т. е. взаимно дополняемые, рецепторам вируса.

7. Некоторые вирусы способны кристаллизоваться и быть в крис­таллической форме.

Номенклатура и классификация вирусов

В настоящее время открыты свыше 3000 вирусов, из которых более 500 поражают человека, животных, насекомых и растения. Выделены новые микроорганизмы - прионы и вироиды.

С целью упорядочения изучения и систематики вирусов уже мно­гие годы проводят классификацию вирусов. Ранее классификацию проводили по виду поражаемых организмов, затем по тропизму, по клинико-этиологическим признакам, по химическому составу и т. д.

В настоящее время принята единая современная классификация ви­русов (1982 г.), согласно которой учитывают следующие критерии: ха­рактеристику вирионов (тип и вид НК (нуклеиновой кислоты), число нитей, морфологию, химические и физические свойства), особенности репликации, генетическое взаимодействие, круг восприимчивых хозя­ев, иатогенность, тропизм, ЦПД в КТ, географическое распростране­ние, способы передачи, антигенные свойства.

По существующей классификации название вирусам в латинском варианте присваивается Международным Комитетом по номенклату­ре вирусов. Название семейств обозначают одним словом с окончани­ем ...idae, родов - тоже одним словом с окончанием ...virus. При этом названия пишут с заглавной буквы. Видовые названия пишут с заг­лавной буквы и включают 2-3 слова и более.

В результате действующей классификации вирусы включены в тип Vira и два подтипа - РНК и ДНК-содержащие.

Вирусы человека и животных разделены в 20 семейств и в том чис­ле ДНК-содержащие вирусы включают 7 семейств и РНК-содержа- щие - 13 семейств.

К числу ДНК-содержащих вирусов отнесены:

Двухнитчатые с оболочкой:

1. Poxviridae - вирусы оспы животных и человека.

2. Herpesviridae - герпес человека, б. Ауески, ИЛТ, б. Марека. i^A

3. Hepadnoviridae - гепатит человека. 1\ рТ

Двухнитчатые без оболочки: _л

4. Iridoviridae - АЧСвиней. ^L

5. Adenoviridae

6. Papovaviridae

Однонитчатые без оболочки:

7. Parvoviridae - парвовирусы человека и животных, АБН. ^ ^ '

К РНК-содержащим вирусам относятся:

Однонитчатые с оболочкой:

АЧСвиней. " _г о

- аденовирус человека, ВГПШ/kOfOd/ ¹

- папилломы, бородавки.

1) Togaviridae - ИЭМ, клещевые энцефалиты, краснуха, диареи, ЕЧСвиней и др.

/

2. Flaviviridae - энцефалиты и др. £

3. Coronaviridae - ИБП, диареи, ТГЭС и др.

4. Paramyxoviridae - б. Ньюкасла, JH^T, корь, ЧСобак (чума собак), ЧКРС, парагрипп.

5. Orthomyxoviridae - грипп А, В, С.

6. Arenaviridae - хориоменингит, геморрагическая лихорадка.

7. Bunjaviridae - лихорадка Рифт, москитная и др.

8. Retroviridae - онкогенные, лейкозы, саркомы, ИНАН, СПИД и др.

9. Rhabdoviridae- бешенство, везикулярный стоматит.

Однонитчатые без оболочки:

2. Picornaviridae - энтеровирусы, полиомиелит, ящур А, О, С, Sat, Азия.

3. Caliciviridae - везикулярная экзантема свиней и др.

У1вихнитчатые без оболочки: _ - __ , ,

2. Reoviridae - A4JI, энцефалит лошадей и др. / Ч НХ V⁴* ^f

3. Birnaviridae - инфекционный бурсит цыплят и др.