1.4.Определение антител к днк

Антитела к ДНК являются объектом интереса широкого круга физиологов и иммунологов. Присутствие больших количеств сывороточных антител к двухцепочечной ДНК является специфичным признаком системной красной волчанки и других аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит и др.

У большинства здоровых людей в сыворотке крови имеются антитела IgM к одноцепочечной ДНК. Эти антитела являются естественными антителами, они имеют низкое сродство к ДНК, тироглобулину и миозину. Напротив, антитела IgG к двухцепочеченой ДНК менее распространены среди здоровых людей и, видимо, включают в себя подгруппы с высоким сродством и ограниченной перекрестной реактивностью [27].

Для определения аутоантител к нативной ДНК используют различные по чувствительности методы, зачастую трудоемкие и не поддающиеся автоматизации.

Наиболее часто используют варианты иммуноферментного анализа, в которых сначала на поверхность полистирольных планшетов для иммуноанализа наносят препарат антигена (нативной или денатурированной ДНК), после чего добавляют сыворотку крови больного и далее - препарат коньюгата специфического антитела и индикаторного фермента (пероксидазы), после чего в реакционную смесь вносят субстрат фермента, дающий в реакции с ферментом окрашенные продукты. Положительным результатом (наличие антител к ДНК в сыворотке крови) служит появление окраски, интенсивность которой зависит от концентрации антител в крови больного. Метод отличается высокой чувствительностью (определение антител в сыворотках с оптимальных рабочим разведением 1:100), но имеет следующие недостатки: (1) длительность стадий инкубирования (общая продолжительность анализа более двух часов); (2) многостадийность определения (три стадии с промежуточными отмывками), (3) необходимость применения коньюгата индикаторного фермента со специфичными антителами [28].

В работе [29] приведен пример амперометрического ДНК – биосенсора для определения антител к ДНК, используя взаимодействие ДНК с комплексами Pt(II). Денатурированную ДНК иммобилизовали на пленке из нитрата целлюлозы. Модифицированная пленка использовалась как биочувствительная часть амперометрического ДНК-сенсора, основанного на стационарном серебряном электроде, покрытом ртутной пленкой. Биосенсор использовали как новый вариант твердофазного иммуноанализа для определения антител к ДНК в сыворотке крови без предварительного разделения компонентов. Содержание антител контролировали по величине тока каталитического выделения водорода при -1.2 ... -1.4 В, наблюдаемого при комплексообразовании соединений платины с ДНК или антителами, соответственно. Метод и ДНК-сенсор использовали в диагностике алеутской болезни норок, при которой в крови животных образуются антитела к ДНК.

В [30] приведен пример вольтамперометрического определения антител к ДНК с использованием золотого электрода, модифицированного ДНК, выступающей в качестве хеморецепторного лиганда. Для иммобилизации ДНК ее молекулу сначала модифицировали дисульфидом, ковалентно связанным с 5'- терминальными группами биополимера. Модифицированная таким образом ДНК образовывала прочные тиольные связи с материалом электрода. Исследования методом циклической вольтамперометрии показали, что обратимая электродная реакция окислительно – восстановительной пары ферроцианид/феррицианид в присутствии ДНК подавляется за счет электростатического отталкивания между иммобилизованной ДНК и ионами маркера. Добавка антител, которые не реагируют с ДНК, не влияет на токи регистрируемые токи феррицианида. Антитела к ДНК, неселективно связывающиеся с с одно – и двухцепочечной ДНК, значительно снижают регистрируемый ток ионов маркера. Эти результаты подтверждают, что связанная с поверхностью электрода ДНК успешно выступает в качестве распознающего элемента для диагностики антител к ДНК в сыворотке крови пациентов.