4. Липофекция

Липосомы - это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов.

Для защиты липосом от преждевременного разрушения используют своего рода стелс-технологии: шарики покрывают слоем полиэтиленгликоля -- инертного вещества, которое делает микрочастицы невидимыми для иммунной системы. Такие микросферы защищают ДНК от ферментов на пути к клетке.

Метод липофекции основан на взаимодействии между положительно заряженными молекулами фосфолипидов, из которых состоят липосомы, и отрицательно заряженными молекулами ДНК. В настоящее время предложены три модели ассоциаций между ДНК и фосфолипидами (Smith et al., 1993).

Например, суть одной из них состоит в том, что положительно заряженные липосомы присоединяются к отрицательно заряженным молекулам ДНК. Число липосом, присоединившихся к ДНК, зависит от размеров молекулы нуклеиновой кислоты. Во втором случае молекулы ДНК "проглатываются" липосомами, то есть ДНК электростатически взаимодействует с внутренней поверхностью липосомы (Рис.4). В третьем случае молекула ДНК окружена несколькими молекулами фосфолипидов, которые формируют своеобразную ленту с нуклеиновой кислотой.

Липосомы, несущие положительный заряд, легко присоединяются к несущей отрицательный заряд плазматической мембране животных клеток, после чего путем эндоцитоза проникают в цитоплазму клеток (Felgner et al., 1987; Behr et al., 1989; Gershon et al., 1993; Smith et al., 1993). Механизмы же, обеспечивающие встраивание в геном и экспрессию ДНК, не достаточно изучены.

Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений.

К преимуществам данного метода можно отнести низкую токсичность липосом по отношению к клеткам, а также то, что экзогенный генетический материал защищен от действия нуклеаз посредством транспортировки в липосомах.

Недостатком данного метода является то, что количество особей, экспрессирующих трансген сокращается с возрастом (Szelei et al., 1994).

5. Трансфекция

При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Для повышения эффективности трансформации к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производится селекция, добавляется неспецифическая ДНК-носитель. Обычно для этой цели берут ДНК из тимуса теленка или спермы лосося. Часть ДНК связывается с мембраной и не попадает в клетки. ДНК акцептируют от 15 до 90% клеток. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток способны экспрессировать чужеродные гены, но затем уровень экспрессии падает и более или менее стабильную трансформацию претерпевает 10-3 - 10-5 клеток.

Для трансфекции используется и ДЭАЭ-декстран, полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 минуты в 15% растворе глицерина в НEPES-буфере).

Векторные (непрямые) методы