55. Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. Restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.

Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина

Полимера́за — фермент, главной биологической функцией которого является синтез полимеров нуклеиновых кислот. ДНК-полимераза и РНК-полимераза синтезируют молекулы ДНК и РНК соответственно, в основном, путём комплементарногокопирования родительских цепей ДНК или РНК. Ферменты, ответственные за сборку других полимеров, не относят к полимеразам. К примеру, ферментативный комплекс, осуществляющий сборку аминокислот в белки, называется рибосомой, а не «белковой полимеразой». Многие полимеразы, полученные из термофильных бактерий.

ДНК-лигаза – это фермент, катализирующий образование фосфодиэфирной связи в двухцепочечной молекуле ДНК, Т.Е. ПРОЦЕСС ЛИГИРОВАНИЯ (СШИВАНИЯ)

ДНК-лигаза фага Т4

– мономерный полипептид (молекулярная масса 68 кДа)

– катализирует образование фосфодиэфирной связи между ‘-фосфатным (5‘-р) и 3 гидроксильным (3‘-ОН) концами ДНК

ДНК-лигаза фагаТ4

обеспечивает объединение любых двуцепочечных фрагментов ДНК , поэтому данный фермент является одним из важнейших ферментов создания рекомбинантных молекул ДНК

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент ( фрагмент Кленова )

56. Трансгенез — это процесс введения чужеродного гена, называемого трансгеном, в живой организм. При этом организм получает свойства, которые он может передавать потомству.

Безвекторные (прямые) методы

1. Метод микроиньекций

В настоящее время широко используемым методом переноса генов (трансгеноза) в получении трансгенных животных является метод микроинъекций. Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора.

Генетическую конструкцию инъецируют в одноклеточный эмбрион - зиготу. В зиготе генетический материал, полученный от отца и матери, находится в двух пузырьках, окруженных ядерной мембраной, - в мужском и женском пронуклеусах. Результативной является микроинъекция в пронуклеус. Как показано многими исследователями, микроинъекция ДНК в цитоплазму не приводит к встраиванию конструкции в геном.

Необходимое количество копий генетической конструкции вводится при помощи микропипетки, закрепленной в держателе микроманипулятора .Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индивидуально метят, берут у них пробу тканей или крови для доказательства интеграции ДНК.

Минусы: не все животные, родившиеся из инъецированных зигот, несут чужеродный ген. А те, которые все-таки являются трансгенными, обычно оказываются мозаичными по введенному гену, то есть несут его не во всех тканях организма. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаичными по трансгену. Факторы, влияющие на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции :степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции и др.

В настоящее время методом микроинъекций удачно получены трансгенные особи некоторых видов рыб (Sin, 1997). Причем процент выживших трансформированных эмбрионов у морских рыб довольно высок - до 85% у лосося (Devlin et al.,1995). Однако процент эмбрионов, несущих инъецированный трансген, и не мозаичных, довольно низок. К примеру, доказана трансгенность всего лишь 6% выживших эмбрионов у лосося, 13% у теляпии (Martinez et al., 1996).

Преимущества: Метод представляет собой быструю одноэтапную процедуру.