2.4 Определение вида Candida

Вид возбудителя определяли с применением микроскопического исследования культуры, биохимической тест-системы Auxacolor 2 (BioRad, США), основанной на биохимических свойствах гриба, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, основанном на определении масс-спектра гриба с помощью прибора «Autoflex Speed» (Bruker, Германия) и сравнением полученных массспектров с масс-спектрами базы данных MALDI Biotyper.

При наличии роста проводили микроскопическое исследование, которое позволяет на основании морфологических признаков выявить Candida albicans и исключить грибы другого рода Cryptococcus, Geotrichum, Malassezia, Trichosporon и Aureobasidium.

Auxacolor 2 (BioRad, США) позволяет определить более 30 видов Candida. С помощью этой системы время идентификации гриба составляет от 24 ч до 72 ч. Тест-система включает 13 тестов ассимиляции разных сахаров, среду с циклогексимидом и тест на фенолоксидазную активность, а также требует учета ряда морфологических признаков и способности культуры к росту при температуре 37⁰С.

MALDI-TOF-масс-спектрометрия на масс-спектрометре Autoflex speed TOF / TOF (Bruker Daltonics, Германия) в линейном режиме позволяет идентифицировать Candida albicans в течение 15 минут. Сбор масс-спектра с образца выполняли в автоматическом и ручном режимах. Идентификация гриба осуществляется при сравнении полученных спектров с референтной базой, с использованием пакета программ MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics). Для дальнейшего анализа выбирали один из двух масс-спектров с наибольшим коэффициентом достоверности. Для сравнения спектров выполняли построение диаграмм с помощью MALDI Biotyper OC. MSP-дендрограммы стро- или по объединенным выборкам масс-50 спектров, полученных из авторских и референтных коллекционных штаммов, на основе которых была создана база для идентификации. В построении кластеров анализа главных компонентов масс-спектров был применен иерархический метод пятой степени.

ПЦР-анализ при стандартных условиях проводился в течение рабочего дня. Важно было, чтобы перед забором материала на протяжении 2-х суток пациент не применял препаратов местного действия (свечи, спринцевания и др.), воздерживался от половых контактов. На протяжении 2-х часов перед забором пациенту рекомендовалось воздерживаться от мочеиспускания. Анализ необходимо сдавать до лечения или не раньше, чем через 21 день после окончания курса антибактериальной, антимикотической терапии (если другое не определено лечащим врачом). Все вышеизложенные рекомендации направлены на то, чтобы с большей точностью определить наличие Candida albicans в исследуемом материале.

2.5 Определение чувствительности Candida albicans к антимикотическим препаратам

Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам in vitro использован метод CLSI M27-A3. Чувствительность определения к следующим препаратам: флуконазолу, вориконазолу, позаконазолу и каспофунгину. Для серийных микроразведений использовали среду RPMI 1640 с добавлением буфера MOPS до получения ph 7 +/- 0,1 при температуре 25ºC, после культивирования в течение 24 часов был приготовлен инокулят, финальный инокулят в каждой из ячеек содержал 5 х 102 – 2,5 х 103 КОЕ/мл. Инкубацию при температуре 35ºC проводили в течение 24 и 48 часов. МИК каспофунгина интерпретировали, как наименьшую концентрацию лекарственного препарата, приводящую к достоверному снижению мутности, что трактуют как приблизительное снижение роста на 50% по сравнению с контролем, культивируемым без добавления препарата.

Оценку чувствительности Candida albicans к флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину и позаконазолу проводили следующим образом: согласно критериям интерпретации метода M27-A3 МИК чувствительных к флуконазолу и каспофунгину штаммов < 2 мкг/мл, умеренно чувствительных – 4 мкг/мл, устойчивых > 8 мкг/мл; МИК чувствительных к вориконазолу штаммов – <1 мкг/мл, умеренно чувствительных – 2 мкг/мл, устойчивых – > 4 мкг/мл, к позаконазолу < 1 мкг/мл. Контроль качества исследования проводили с использованием тест – культуры C. parapsilosis.