11. Методы культивирования облигатно-анаэробных микроорганизмов. Особенности питательных сред для них.

Выведение облигатно анаэробных микроорганизмов существенно отличается от изучения других типов бактерий, так как если в атмосфере содержание О2 будет превышать 0,1%, то они погибнут. Поэтому при изучении этих микроорганизмов необходимо соблюдать определённые правила, иначе их нарушение может привезти к искажению результата или вовсе гибели анаэробов. Первым, кто смог удачно произвести выделение анаэробов, стал Л.Пастер на исходе XIX века. С того времени учёные применяли огромное количество способов и методов для выведения данных микроорганизмов, от многих пришлось отказаться в виду их сложности или не практичности, но на замену им пришли более совершенные современные методы.

Специфика выведения анаэробов.

Для правильного культивирования анаэробов, необходима специально подготовленная среда, отвечающая определённым требованиям:

А) удовлетворять пищевым требованиям анаэробов и способствовать их стабильному и здоровому росту (пептоны - 2%,гемин и др.)

Б) В случаях необходимости, содержать в себе добавки для стимуляции развития (например, лошадиная сыворотка (до 10%).

В) Наличие низкого окислительно-восстановительного потенциала. Этого можно достичь, добавив в среду редуцирующий элемент.

Г) Наличие селективных добавок. В большинстве случаев используется аминогликозидный ряд антибиотиков.

Кроме того, для удачного культивирования анаэробных бактерий необходимо следить за тем, чтобы содержание кислорода не превышало 0,1%. Для этого используются анаэробные камеры, микроанаэростаты или анаэробные пакеты.

А) Анаэробные камеры – прозрачная, герметичная станция, может быть как перчаточной, так и безперчаточной. Необходимые условия создаются в ней посредством возникновения вакуума и добавления двухкомпонентного ( N2 +H2) или трёхкомпонентного ( N2+CO2+H2) анаэробного газа. Камера оснащена специальными шлюзами, для лёгкого введения необходимых образцов и материалов, термостатом, контролирующим влажность, приборы для регуляции концентрации кислорода и его вывода из рабочей зоны. Так как данный агрегат обеспечивает самое высокое качество культивирования среди своих аналогов, он является довольно дорогим удовольствием, в основном его могут позволить основные исследовательские лаборатории или же частные центры изучения. Кроме этого его удобство также обусловлено внушающей вместительностью до двухсот чашек Петри.

Б) Микроанаэростат – бочкообразная, герметично закрываемая металлическая или пластмассовая ёмкость объёмом от 2 до 7 литров. Создание необходимых условий в агрегате происходит двумя способами:

1)вакуумозамещение – создаётся вакуум и запускается анаэробный газ.

2)Химическое связывание кислорода – с использованием газогенерирующей системы, генерирующие H2 и СО2. H2 – поглощает лишний кислород при появлении воды в системе, СО2 – является стимулятором роста для изучаемых микроорганизмов.

Контроль за бескислородной средой в микроанаэростатах контролируется специальной полоской-индикатором, которая при удалении кислорода из рабочей среды – обесцвечивается. Основным недостатком данного агрегата является то, что исследования проводятся в кислородосодержащей среде и только потом помещаются в микроанаэростат, из-за чего качество результатов уступает анаэробной камере. Вместимость его до двенадцати чашек Петри и в основном используется в небольших лабораториях.

В) Анаэробный пакет – это прозрачный пластиковый пакет с герметичным закрыванием и объёмом до двух чашек Петри. Создание анаэробных условий создаётся путём взаимодействия реакционной безводной системы с кислородом. Пакет, как и в случае с микроанаэростатом, оснащён полоской-индикатором. Анаэробные пакеты являются наиболее практичным способом, удобным в экстренных и полевых условиях, и при этом показывают удовлетворительные по качеству результаты, хоть и ниже, чем у вышеназванных агрегатов.

Особенности питательных сред: низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кислород. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения

С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусочки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный белок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирующее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта—Тароцци — традиционная среда для культивирования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, которую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют кусочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, затем охлаждают и только после этого проводят посев.

Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.

Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.

Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.

Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стеклянным трубкам — трубкам Вейона Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.

Широко применяют культивирование анаэробов на поверхности плотных питательных сред в чашках Петри.

Из числа плотных сред для культивирования анаэробов довольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.

Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА, расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибринированной крови барана и разливают по чашкам Петри.

Железо-сульфитный агар (среда Вильсон—Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чашкам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлоридом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.

Для культивирования анаэробов на поверхности плотных питательных сред недостаточно добавления в них восстанавливающих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в герметические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным способом создают анаэробные (бескислородные) условия.