2. Определение общего белка по биуретовой реакции

Цель: Определить общий белок в сыворотке крови и сравнить, полученные данные с референсными значениями.

Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых про­дуктов, важнейшая роль принадлежит белкам. Их основное зна­чение заключается в незаменимости другими юмпонентами пи­щи. Белки составляют основу процессов жизнедеятельности орга­низма. Необходимость их постоянного обновления лежит в осно­ве обмена веществ.

Белки в организме выполняют структурную (построение тка­ней и клеточных компонентов) и функциональную (ферменты, гормоны, дыхательные пигменты и др.) роль.

Дефицит белка в пищевом рационе повышает восприимчи­вость организма к инфекционным заболеваниям, нарушает про­цессы кроветворения, обмен лицидов, витаминов и др. У детей при белковой недостаточности замедляются рост и умственное

развитие.

Длительный избыток белка в питании также отрицательно сказывается на жизнедеятельности организма, вызывая перевозбудимость нервной системы, нарушение обменных процессов, пе­регрузку печени и почек. В ежедневном рационе взрослого человека белки должны со­ставлять около 14% общей калорийности, сочетаясь в определен­ном соотношении с другими пищевыми веществами. Известно, что растительные белки усваиваются организмом не полностью по сравнению с животными. Так, белки молока и яиц усваиваются на 96%, белки рыбы и мяса —на 95%, белки хлеба из муки пшеничной I и II сортов —на 85%, белки карто­феля, хлеба из обойной муки, бобовых — на 70%, Учитывая, что растительные белки менее полноценны по составу незаменимых аминокислот, чем животные, потребление определенного количе­ства животных белков совершенно (необходимо. Для взрослого человека доля животных белков в среднем должна составлять около 55% общего количества белка в рационе.

Массовую долю белка в пищевых продуктах определяют по Количеству общего азота методом Кьельдаля. С развитием фото-и спектрофотометрии были разработаны методы количественного определения белка, основанные на его способности давать окра­шенные соединения с (некоторыми реагентами) среди них следует отметить метод Доури, биуретовый метод. Находят применение также физико-химические методы, в основу которых полажены специфические свойства белка: образование различной степени помутнения в зависимости от концентрации белка в растворе сульфосалициловой кислоты (нефелометрический метод), способ­ность белка адсорбировать некоторые красители и другие свой­ства белка.

Все перечисленные методы могут быть отнесены к ускоренным. При относительно небольших затратах времени они харак­теризуются достаточно высокой точностью и простотой определе­ния.

Принцип метода: Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu²⁺ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.

Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить двумя способами:

1) путем сравнения с оптической плотностью стандартного раствора с известной концентрацией опре­деляемого вещества.

Для этого составляют пропорцию:

Е_ст. соответствует С_ст.

Е_оп. соответствует С_оп.

С_ст. х Е_оп.

откуда С_оп.= ,,

Е_ст.

где Е_ст. - экстинкция стандартного раствора; Е_оп. - экстинкция исследуемого раствора; С_ст. - концентрация стандартного раствора; С_оп. - концентрация определяемого вещества.

2) или, более точно, в результате построения калибровочной кривой по стандартному раствору. В этом случае из стандартного раствора готовят серию рабочих растворов с известной концентрацией исследуемого вещества, проделывают с ними необходимые химические реакции и измеряют на ФЭКе оптическую плотность.

Результаты проведенных исследований оформляют в виде таблицы:

Концентрация вещества	Оптическая плотность (Е)

Полученные результаты отражают графически, откладывая по оси абсцисс концентрацию вещества, а по оси ординат – соответствующую ей оптическую плотность. Определив оптическую плотность исследуемого раствора, находят содержание в нем вещества по калибровочной кривой.

Выводы

Физиологическая роль белков плазмы крови многогранна:

1. Поддержание онкотического давления и тем самым сохранение объема циркулирующей крови. В этом процессе особенно велика роль альбуминов.

2. Участие в свёртывании крови. Ряд белков плазмы, в том числе фибриноген, являются компонентами системы свертывания крови.

3. Поддержание постоянного рН крови (белки плазмы составляют часть буфер­ных систем крови).

4. Транспортная функция. Белки плазмы (альбумин, транскортин, тироксинсвязывающий белок, транскобаламины, трансферрин, церулоплазмин и др.) переносят нерастворимые вещества (липиды, билирубин, жирные кислоты, жирорастворимые витамины и др.) в ткани и органы. Как правило, транспортные белки способны связывать и переносить один лиганд, исключение — альбумины, которые могут переносить жирные кислоты, ряд гормонов, металлы и др.

5. Участие в иммунных процессах организма (защитная функция). Сывороточные иммуноглобулины входят в состав фракции  - глобулинов сыворотки крови.

6. Поддержание уровней катионов в крови путем образования с ними соединений. Например, 40-5-% ионов Са^»+ и других элементов связаны с белками сыворотки.

7. Сывороточные белки образуют «белковый резерв» организма. При голодании они могут распадаться до аминокислот, которые используются для синтеза белков головного мозга, миокарда и других органов.

Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Определение общего белка используется в диагностике и лечении различных заболеваний, включая заболевания печени, почек, костного мозга, а также нарушений метаболизма и питания.

Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Таким образом, общий белок сыворотки представляет собой сумму всех циркулирующих белков и является основной составной частью крови.

Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65 - 85 г/л – взрослые (причем на альбу­мины приходится 40-50 г/л), 57 – 80 г/л дети (1 - 18 лет), 41 – 63 г/л – новорожденные.

Гиперпротеинемия (>85 г/л) - повышенное содержание белка встречается при острых (увеличение синтеза белков острой фазы) и хронических (за счет  - глобулинемии) инфекциях др. генерализованные перетониты и т.д.). Приблизительно на 10% может повысить концентрацию белка в течение 30 минут изменение горизонтального положения тела на вертикальное, а также - активная физическая работа.

Гипопротеинемия (<65 г/л) - пониженное содержание белка в крови связано чаще всего с уменьшением фракции альбуминов крови. Истинная (абсолютная) гипопротеинемия встречается при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек и т.д.), при усиленном распаде белков (тяжелые инфекции, длительные восполительные процессы, лихорадочные состояния и др.). Физиологическая гипопротеинемия может наблюдаться у детей раннего возраста, у женщин во время беременности (особенно в третьем триместре), при лактации, при длительном постельном режиме.

Диспротеинемия – изменение процентного соотношения отдельных белковых фракций при постоянном общем содержании белков.

В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, гамма - глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).